金属腐蚀不仅会造成严重的经济损失和资源浪费，还会引发安全事故^[1]。据统计，每年由金属腐蚀造成的经济损失中有20%是由微生物引起的^[2,3]。硫酸盐还原菌 (SRB) 作为研究最多的腐蚀微生物，广泛存在于海洋环境中^[3]，因此有必要针对海洋环境中SRB的腐蚀问题开展研究。

目前，添加缓蚀杀菌剂是抑制金属微生物腐蚀最简单有效的方式。噻二唑衍生物由于含有氮、硫原子以及极性基团，可在金属表面形成吸附膜而被广泛用作金属缓蚀剂^[4,5]。同时，研究发现噻二唑衍生物亦具有抗菌、抗病毒等生物活性^[6]。另一方面，季铵盐表面活性剂因其优异的杀菌性能^[7,8]，一直是一类被广泛应用的杀菌剂，同时由于其具有良好的表面活性，能够在金属界面定向吸附形成致密的吸附膜，因而也可用作金属缓蚀剂^[9]。研究表明，在表面活性剂分子中引入杂环结构，可以提高其对金属的缓蚀性能。例如，咪唑啉型阳离子表面活性剂在HCl、H₂SO₄以及饱和CO₂中对碳钢均有良好的缓蚀效果^[10-12]。本课题组也通过研究发现，杂环化合物与表面活性剂可以通过分子内协同效应，提高其对碳钢的缓蚀性能^[13,14]。为了进一步深入研究杂环结构与表面活性剂的分子内协同效应，本文合成了含噻二唑杂环的季铵盐表面活性剂，期望通过噻二唑杂环和季铵盐表面活性剂的分子内协同效应，增强二者的杀菌性能及在界面的定向吸附能力，提高碳钢在含SRB环境中的缓蚀性能。

本文合成了一种新型的含噻二唑杂环的季铵盐表面活性剂，通过表面活性测试、电化学测试、表面分析等方法，研究其表面活性以及在含SRB的模拟海水环境中对碳钢的缓蚀性能，为新型高效缓蚀杀菌剂的研究提供理论指导。

SRB菌株购自中国普通微生物菌种保藏中心 (脱硫脱硫弧菌脱硫亚种，1.3469)。SRB培养基成分 (g/L) 为：K₂HPO₄ 0.5，NH₄Cl 1.0，Na₂SO₄ 1.0，CaCl₂·2H₂O 0.1，MgSO₄·7H₂O 2.0，DL-乳酸钠2.0，酵母提取物1.0。使用45^#碳钢作为实验材料，其元素组成 (质量分数，%) 为：C 0.50，Si 0.37，Mn 0.8，S 0.045，P 0.04，Cr 0.25，Ni 0.25，Cu 0.25，其余为Fe。实验用三聚氯氰为工业级；十二烷基二甲基苄基氯化铵 (1227)、正辛胺、2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑、N,N-二甲基-1，3-丙二胺、溴乙烷、甲苯、丙酮、无水乙醇、氯化钠均为分析纯

含噻二唑季铵盐表面活性剂的合成路线如图1所示。

向500 mL三口瓶中加入9.23 g (0.05 mol) 三聚氯氰和100 mL甲苯，-5~0 ℃搅拌至完全溶解。将9.11 g正辛胺 (0.055 mol) 溶解在50 mL甲苯中。将正辛胺的甲苯溶液逐滴加入到三口瓶中，维持反应温度-5~0 ℃和pH8~9，薄层色谱 (硅胶GF254，甲苯∶甲醇=1∶1，v/v) 监测反应至结束。反应结束后滤去不溶物，滤液依次用1 mol/L盐酸、0.5 mol/L NaHCO₃、蒸馏水洗涤至中性，有机层用无水硫酸钠干燥过夜，过滤、旋蒸析出产物I (产率92%)。向500 mL三口瓶中加入13.86 g产物I (0.05 mol) 和100 mL丙酮，搅拌下升温至45~50 ℃。将7.3 g 2-巯基-5-甲基-1，3，4-噻二唑 (0.055 mol) 溶于50 mL丙酮-水混合溶剂 (V_丙酮∶V_水=2∶1)，待产物I完全溶解后，逐滴加入至三口瓶，45~50 ℃下搅拌反应8 h。向反应液中加蒸馏水，析出大量白色固体，抽滤并用热丙酮洗涤滤饼，真空干燥得产物Ⅱ (产率76%)。向100 mL的三口瓶中加入30 mL N，N-二甲基-1，3-丙二胺，维持反应温度30 ℃。搅拌下将18.6 g产物Ⅱ (0.05 mol) 少量多次加入三口瓶中，薄层色谱 (硅胶GF254，丙酮∶甲苯∶水=6∶1∶0.5，v/v/v) 监测反应至结束。向反应液中加入100 mL甲苯，转移至分液漏斗，用饱和NaCl多次洗涤至中性。有机层用无水硫酸钠干燥过夜，抽滤、减压浓缩、真空干燥得白色固体，即产物Ⅲ (产率65%)。将4.38 g产物Ⅲ (0.01 mol)，1.62 g溴乙烷 (0.015 mol)，150 mL乙腈加入500 mL三口瓶，60 ℃搅拌反应，薄层色谱 (硅胶GF254，丙酮∶甲苯∶水=6∶1∶1，v/v/v) 监测反应至结束。反应液旋蒸得淡黄色粗品，丙酮重结晶3次即得含噻二唑季铵盐表面活性剂。

采用Exactive Plus高分辨质谱仪 (ESI-MS)、Bruker-600核磁共振波谱仪 (¹HNMR) 和TENSOR 27型Fourier变换红外光谱仪 (FT-IR) 对所合成的MTOTB结构进行表征。

在3.5% (质量分数) NaCl溶液中加入SRB的培养基成分用于模拟海水环境^[15]，然后用模拟海水配制一系列不同浓度的MTOTB溶液。使用K100型表面张力仪在30 ℃下采用Wilhelmy法测量溶液的表面张力。

将SRB培养基成分称量好并溶于适量蒸馏水中，用1 L容量瓶定容至刻度。将配好的溶液煮沸10 min，冷却后用0.01 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH至7.8，于121 ℃，0.1 MPa下灭菌20 min。实验开始前，将FeSO₄·7H₂O 0.5 g/L、巯基乙酸钠 0.1 g/L以及抗坏血酸 0.1 g/L称好，均匀摊开在称量纸上，于距离紫外灯30 cm处杀菌30 min。然后，在超净工作台中将药品溶于灭菌后的溶液中，摇匀备用。

从冰箱中取一支SRB菌种，置于30 ℃恒温生化培养箱中保温2 h，取15 mL菌液接种，将菌液移入100 mL的厌氧瓶中加灭菌后的培养基至瓶口，置于30 ℃恒温生化培养箱中培养24 h。24 h后若瓶中颜色变黑，则表示菌种活化成功，若瓶中颜色未变黑，则适当延长培养时间^[16]。

将碳钢电极与铜导线焊接，仅暴露一个正方形端面 (1.0 cm²) 作为工作面，其余部分用环氧树脂密封。用120#~5000#的水相砂纸逐级打磨至镜面，丙酮脱脂，无水乙醇脱水，经冷风吹干后用保鲜膜密封待用。实验前，将处理好的电极片置于超净工作台中紫外杀菌30 min。在装有无菌模拟海水的厌氧瓶中加入碳钢电极和不同浓度的MTOTB。除无菌对照之外，每个瓶中分别加入2 mL SRB种子液 (菌浓为10⁷ 个/mL)，所用厌氧瓶最终溶液体积均为100 mL。每个厌氧瓶通氮气5 min，密封，置于 (30±1) ℃培养箱中21 d。从厌氧瓶中取出电极片，于超净工作台中进行电化学测试。

使用CHI660型电化学工作站进行电化学测试，三电极体系，饱和甘汞电极作为参比电极，铂电极为辅助电极，在厌氧瓶中浸泡后的碳钢电极为工作电极。测试时，首先将组装好的三电极体系浸泡在 (30±1) ℃的测试溶液中1 h，以获得稳定的开路电位 (OCP)。待OCP稳定后，进行电化学阻抗谱 (EIS) 测试，扫描频率范围为10⁵~10^-2 Hz，施加振幅为10 mV的扰动电位。测试所得阻抗数据用Zsimpwin 3.30阻抗拟合软件进行分析。

将尺寸为5 mm×5 mm×2 mm的碳钢片用水相砂纸逐级打磨至镜面，无水乙醇清洗后浸入未添加和添加MTOTB的含菌模拟海水中，于30 ℃培养箱中培养21 d。取出碳钢片，置于含2.5% (v/v) 戊二醛的磷酸缓冲液中8 h，以固定附着在试样表面的生物膜。然后用无菌蒸馏水冲洗试样，用一系列梯度浓度乙醇 (50%、75%、85%、95%、99%) 分别脱水10 min，无水乙醇脱水30 min，N₂流干燥^[17]后使用JSM-7200F型扫描电镜 (SEM) 对碳钢样片表面的微观腐蚀形貌进行观察，使用NORAN System 7型X射线能谱仪 (EDS) 分析碳钢样片表面元素组成。利用ESCALAB250Xi型X射线光电子能谱仪 (XPS) 分析碳钢样片表面生物膜和腐蚀产物中的主要化学成分。

ESI-MS测试结果如图2所示。由图2可知，467.2724 (m/z) 为MTOTB的[M-Br]⁺峰。

选用DMSO-d₆为溶剂对MTOTB进行了NMR测试，结果见图3。分析得到的谱图数据如下：0.843~0.866 (t，CH₃—CH₂—CH₂—，3H)，1.210~1.243 (m，CH₃—(CH₂)₅—CH₂—CH₂—&CH₃—CH₂—N—，13H)，1.451~1.510 (d，—CH₂—CH₂—NH—，2H)，1.865~1.940 (d，(CH₃)₂—N—CH₂—CH₂—，2H)，2.742~2.774 (d，CH₃—C—，3H)，2.982~3.058 (d，(CH₃)₂—N—CH₂—，6H)，3.189~3.341 (m，2(CH₂—NH—)&(CH₂—N—CH₂)，8H)，7.536~7.735 (t，2(C—NH—)，2H)。

通过KBr压片法对MTOTB进行了FT-IR谱图测试，结果见图4。其中3265 cm^-1为N—H伸缩振动峰；2928和2855 cm^-1为甲基和亚甲基中C—H伸缩振动峰；1558 cm^-1为C=N伸缩振动峰；1296 cm^-1为C—N伸缩振动峰；1090 cm^-1为N—N=伸缩振动峰；725 cm^-1为—(CH₂)_n—面内摇摆振动峰；661 cm^-1为C—S伸缩振动峰。

通过结构表征分析，说明合成了目标化合物。

图5为利用表面张力法测得的30 ℃时MTOTB在模拟海水中的表面张力随浓度的变化曲线 (γ-lgc)。由图5可知，随着MTOTB浓度的增加，溶液的表面张力先急剧降低；当MTOTB的浓度达到某一值后，继续增加MTOTB的浓度，溶液的表面张力基本保持不变。这与常规表面活性剂的性质一致，对应曲线拐点处的浓度即为30 ℃时MTOTB在模拟海水中的临界胶束浓度 (cmc)，该浓度对应的表面张力即为平衡表面张力 (γ_cmc)。由图5可知，30 ℃时，MTOTB在模拟海水中的cmc值与γ_cmc值分别为0.11 mmol/L和35.7 mN·m^-1，说明其具有较好的表面活性。根据γ-lgc曲线，代入Gibbs吸附等温式^[18]，可得MTOTB在溶液界面的饱和吸附量Γ_max和A_min分别为1.52×10^-10 mol·cm^-2和1.09 nm²。

式中，R为气体常数 (8.314 J·mol^-1·K^-1)，T为绝对温度，γ为表面张力 (mN·m^-1)，c为表面活性剂水溶液的浓度 (mol·L^-1)，A_min为饱和吸附时在溶液界面每个吸附分子所占的最小面积，N_A为阿伏加德罗常数。

最低抑菌浓度 (MICs) 是指杀菌剂在规定的体外条件和规定的时间内，抑制微生物可见生长的最低抑制剂浓度。这个浓度的值往往是评价杀菌剂性能是否优良的一个重要指标，也是对该种杀菌剂进行微生物腐蚀研究的起点。所合成的MTOTB的最低抑菌浓度采用文献中报道的标准2倍稀释法测定^[19]。

本文使用经活化处理且稀释后的菌量在10⁶个/mL数量级的纯种SRB菌液，对新合成的含噻二唑季铵盐表面活性剂进行杀菌性能实验，测定其最低抑菌浓度，并使用传统杀菌剂—十二烷基二甲基苄基氯化铵 (1227) 作为对照研究。结果表明，1227和MTOTB的最低抑菌浓度分别为0.30和0.031 mmol/L。从实验结果可以看出，与1227相比，所合成的MTOTB具有更高的杀菌活性，可能是由于MTOTB的杀菌方式不仅是由于化合物中带正电荷的亲水头基与SRB带负电荷的磷脂相互作用，改变了细胞膜的选择渗透性，引起细菌的抑制、变性和死亡，还包括杂环基团对菌体的抑制杀菌作用，这种联合杀菌作用有效提高了其杀菌活性。

采用MPN法^[20]测定了SRB在模拟海水中的生长曲线，结果如图6所示。可以看出，SRB的生长曲线包括4个阶段，第一阶段是细菌适应生长介质和条件的延滞期，持续时间大约为3 d。在延滞期内，SRB个体菌株生长并成熟，但尚未分化。此后，SRB进入对数生长期，此阶段介质中营养物质充足，细菌活性高，SRB生长呈指数级加速，直至达到最大生长速率。随后，SRB生长速率减缓并进入平稳期，此时介质中的SRB数量达最大值。最后进入衰亡期。由于营养物质消耗及有害代谢产物的积累，体系中活性SRB数量开始不断减少，但体系处于厌氧状态，所以SRB在一定时间内能够保持一定的数量。因此，腐蚀实验均选用培养7 d的菌种作为工作菌，腐蚀实验碳钢试样浸泡时间为21 d。

图7为碳钢在添加不同浓度MTOTB的含SRB的30 ℃模拟海水中浸泡21 d后测试的电化学阻抗谱图。从Nyquist图中可以看出，空白溶液与模拟海水阻抗谱图都近似为一个不完整的半圆。与空白对照相比，MTOTB的添加显著增加了容抗弧的半圆直径，表明碳钢的腐蚀被有效抑制^[21]。采用图8所示等效电路拟合电化学阻抗谱图。

在等效电路中，用恒相元件CPE代替电容。图8中，R_s为溶液电阻，R_f和CPE_f分别为生物膜/腐蚀产物膜的电阻和电容，R_ct和CPE_dl分别表示电荷转移电阻和双电层电容。CPE的阻抗值由下式计算得到^[15]：

式中，Z_CPE和Y₀分别为CPE的阻抗和导纳，j为虚根，ω为角频率 (ω=2πf_max，其中f_max为阻抗的虚部达到最大值时对应的频率)，n为CPE的弥散效应指数。当n=0时，CPE表示纯电阻；当n=1时，CPE表示理想双电层电容。由式 (6) 计算双层电容C_dl^[22]，由式 (7) 计算缓蚀率η_eis^[23]。表1为电化学阻抗拟合数据。

式中，R_p⁰和R_p分别为在未添加和添加缓蚀剂的溶液中的腐蚀电阻 (R_p=R_f+R_ct)。

由表1中数据可知，与SRB介质相比，MTOTB的添加使R_ct值增大和C_dl值减小，表明MTOTB的存在减缓了碳钢在含SRB的模拟海水中的腐蚀^[24]。电荷转移电阻随着MTOTB浓度的增加先增大后降低；当浓度为0.2 mmol/L时，R_ct值达最大，相应的η_eis最高。MTOTB能够减缓碳钢在含SRB的模拟海水中的腐蚀主要有两方面原因。一方面，MTOTB的加入，抑制了SRB活性并破坏细胞膜的选择渗透性导致其死亡；另一方面，MTOTB分子结构中多个活性中心与SRB在碳钢表面竞争吸附，且其比SRB更易与碳钢表面原子相互作用，形成吸附膜，阻止碳钢基体与腐蚀介质接触，达到缓蚀的目的。随MTOTB浓度的增加，碳钢表面的吸附膜更加致密，覆盖度更大，当达到0.2 mmol/L后，继续增加其浓度，覆盖度下降，缓蚀率相应降低。研究^[16]表明，覆盖度的变化可能与MTOTB在碳钢表面的吸附方式有关。随着MTOTB的浓度增大，溶液中过多的MTOTB离子头基之间由于过饱和而产生斥力，导致由原本以NH₄⁺与三嗪环为主要活性吸附中心的缓蚀剂分子逐渐脱附，覆盖度下降，缓蚀效率降低，在图7a中则表现为容抗弧直径的减小。

图9显示了30 ℃下碳钢试样在未添加和添加0.1 mmol/L MTOTB的含SRB模拟海水中浸泡21 d后表面生物膜和腐蚀产物的微观结构图。图9a为抛光打磨的碳钢试样表面形貌图，可以看出其表面光滑平整，纹理清晰。图9b显示了碳钢试样在SRB介质中浸泡21 d后的腐蚀形貌，从图中可以看出，碳钢表面覆盖了一层疏松多孔的腐蚀产物层。相应的EDS数据显示，SRB介质中的碳钢表面含有丰富的S，表明存在FeS腐蚀产物^[25]。而图9c表明，在0.1 mmol/L MTOTB存在下，碳钢表面未发现固着SRB菌株，且其表面结构仍然清晰。在碳钢表面出现了少量的S和N，证实了MTOTB可以有效地吸附在碳钢表面，降低了碳钢的腐蚀速率。

为进一步研究碳钢表面SRB生物膜的主要元素价态及MTOTB对SRB腐蚀产物的影响，测试了碳钢试样在SRB介质以及含0.1 mmol/L MTOTB的模拟海水中浸泡21 d后的XPS谱图，得到的高分辨能谱如图10所示，分峰拟合结果列于表2。

图10中C 1s的高分辨率能谱中C—N和C—H分峰的出现说明MTOTB分子结构可以有效吸附于碳钢表面。在SRB介质中出现了有机O和C=O基团，但在含MTOTB的模拟海水中并未出现，表明在仅含SRB的模拟海水中，试样表面形成了生物膜，产生了更多的有机物^[26]。图10c显示了Fe 2p能谱的拟合结果，在SRB介质中，Fe 2p的谱图可拟合分为5个峰，其结合能 (eV) 数值依次为 710.40、711.40、712.28、713.01、724.84，分别对应FeS、Fe₂O₃、FePO₄、FeSO₄、Fe₃O₄^[16,27]。与添加MTOTB的试样相比，SRB诱导的碳钢腐蚀的主要腐蚀产物正从Fe的氧化物逐渐转变为Fe的硫化物。如图10d所示，在SRB介质中拟合的S 2p高分辨率能谱存在5个峰。其中在161.20、162.02和163.30 eV处出现的峰值为FeS和FeS₂，这是SRB诱导腐蚀的标志性产物，SRB通过生长代谢将SO₄^2-还原为FeS和FeS₂，而这些产物在含MTOTB的介质中不存在，这一结果与SEM-EDS测试结果一致。在167.90 eV处的SO₄^2-峰是由培养基成分引入的，而在含MTOTB的介质中存在的C=S峰 (163.40和163.9 eV) 则是缓蚀剂吸附作用所致^[28]。图10e中显示了N 1s高分辨率能谱，399.87 eV处的C=N峰可归因于模拟海水中SRB产生的代谢物，而402.3 eV处的C=N峰值仅出现在含MTOTB介质中，可归因于噻二唑缓蚀剂在碳钢表面的吸附^[27]。

(1) 合成的一种含噻二唑的季铵盐表面活性剂 (MTOTB) 具有良好的表面活性。

(2) MTOTB对SRB的最低抑菌浓度为0.031 mmol/L，远低于同条件下1227对SRB的最低抑菌浓度，说明噻二唑和季铵盐表面活性剂的分子内协同效应可以显著提高其杀菌性能。

(3) MTOTB的加入可以有效减缓碳钢片在含SRB菌的模拟海水中的腐蚀；当MTOTB添加量为0.2 mmol/时，缓蚀效率可达95.81%。

(4) 在模拟海水中，MTOTB可以有效地吸附在碳钢表面，在碳钢表面形成吸附膜，显著减缓碳钢的微生物腐蚀。