海洋环境是目前已知的最为复杂的腐蚀环境^[1]。随着海洋工程的快速发展，许多大型混凝土结构，如海港码头、石油平台、管道和冷却塔等建筑需要长时间暴露在海水环境中，这对混凝土结构的防腐蚀性能提出了非常高的要求。根据中国工程院腐蚀调查，2014年中国腐蚀造成的年损失约占当年GDP的3%~5%，其中海洋腐蚀约占总腐蚀成本的1/3^[2,3]。因此，由于海洋环境造成的腐蚀经济损失非常巨大^[4]。

由于海水的各种冲击以及化学离子的侵蚀^[3]，使暴露在海洋环境中的混凝土发生劣化，出现混凝土碳化、开裂、脱落等耐久性问题，所以海洋混凝土结构的实际使用寿命往往比设计寿命短得多^[4]。暴露在潮汐区的混凝土结构不仅受到干湿循环的影响，同时也容易受到微生物的附着和侵蚀^[5,6]。微生物会在混凝土表面及其孔隙、微裂纹等位置处定居、生长，其中的集料矿物被微生物当做“营养物质”所溶解，造成混凝土表面出现微生物腐蚀^[7,8]。

1945年，Parker^[9]首次提出了污水管道混凝土的腐蚀破坏与微生物新陈代谢的关系，揭示了微生物对混凝土腐蚀的诱因。进一步研究表明，微生物有一种自然的倾向附着在湿润的表面，通过产生胞外聚合物 (EPS)，增强了表面的附着力，逐渐形成生物膜，这也为细菌的生长提供了独特的环境。所以，微生物腐蚀易发生在不同养分含量、温度、压力和pH值的水生环境下^[10]。吕建福等^[11,12]对海洋浪溅区和潮汐区的混凝土表面微生物进行了16srna鉴定分析，表明混凝土表面存在的微生物群落结构不同，各物种对混凝土的作用也不同。在生物膜中，多个引起腐蚀的生物体可以协同作用，不同物种之间的相互作用可能在生物膜的有氧和缺氧部分诱导一系列生物化学反应，产生更严重的腐蚀，可以说生物膜是生物污染、生物降解和生物腐蚀发生的中心^[13,14]。因此，如何抑制生物膜在混凝土表面的形成与生长，对于控制海洋生物腐蚀具有重要的意义。

涂层防护是目前混凝土腐蚀防护领域应用最广泛的措施之一^[15]。表面涂层可以将混凝土转变成不易受到水或其他化学物质渗透的材料，减轻了由侵蚀性介质引起的对混凝土结构的损伤^[16,17]。课题组前期研究表明^[18,19]，正硅酸乙酯 (TEOS)/异丁基三乙氧基硅烷 (IBTS) 复合乳液可在混凝土表层形成渗透性防护涂层，提高了混凝土表面的接触角，降低其表面能，提升混凝土的防水性能。这种疏水表面同时可以抑制微生物的吸附，并能使涂层表面的污损物易去除，具有优异的自清洁功能^[20]。

为了进一步研究TEOS/IBTS复合乳液在海洋潮汐区对混凝土的防生物污损效果，本文采用接触角分析了经过12个月暴露后混凝土表面的疏水性能；采用16srna高通量测序对海水中混凝土表面微生物群落结构进行分析，探讨TEOS/IBTS复合涂层对表面微生物群落和功能微生物的影响，了解微生物在混凝土表面的定植过程；此外，利用共聚焦扫描激光显微镜 (CLSM) 观测了混凝土表面生物膜内的细菌种群生存力及活死细菌的分布情况；利用扫描电镜 (SEM)、能谱分析 (EDS) 对混凝土表面的微观形貌进行分析，为后期研究TEOS/IBTS复合涂层对海洋潮汐区混凝土的抗生物腐蚀效果提供参考和依据。

实验所用硅烷单体为异丁基三乙氧基硅烷IBTS和正硅酸乙酯TEOS，乳化剂采用Span80和PPG O，分散剂为PEG2000溶剂，为蒸馏水，所有试剂均为分析纯。通过溶胶-凝胶法制备TEOS/IBTS复合乳液^[19]。

制备混凝土所用水泥为P·O42.5硅酸盐水泥 (山东东岳水泥有限公司)，细集料选用颗粒级配良好的河砂，骨料选用玄武岩碎石，减水剂选用聚羧酸减水剂 (江苏苏博特新材料股份有限公司)，自来水来源青岛本地。按照混凝土配合比 (表1) 制备尺寸为100 mm×100 mm×400 mm的标准试块，脱模后置于标准养护室 (温度 (20±2) ℃，湿度98%) 养护，28 d后取出，置于烘箱 (50~60 ℃) 中干燥2 d。干燥结束后，将TEOS/IBTS复合乳液涂覆在混凝土400 mm×100 mm的两个侧面，用量为600 g/m²，其余四个侧面采用环氧树脂封闭。涂覆结束后，将试块放置于在青岛市海水环境材料腐蚀国家野外科学观测研究站进行实海暴露实验，放置区域为海洋潮汐区，暴露时间为3、6、9、12个月。

混凝土达到一定暴露时间后，采用SL150静态接触角测定仪，利用悬滴法测量混凝土表面的静态接触角，每个试块至少在5个位置测量接触角，取其平均值，并测算混凝土表面能。

使用干净的无菌金属小刮刀刮取混凝土表面，收集大约5 mL的生物膜样品并快速转移到无菌离心管中^[32,33]，在低温下 (4 ℃) 进行冷藏贮存。根据MP Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals) 说明书进行微生物群落总DNA提取，使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，使用NanoDrop 2000测定DNA浓度和纯度，经检测合格的基因组DNA样品进行Illumina Miseq测序 (上海美吉生物医药科技有限公司)。

使用338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3') 和806R (5'-GGACTACHVGGGTWT CTAAT-3') 对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序如下：95 ℃预变性3 min，27个循环 (95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存 (PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型)。PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物 (5 μmol/L) 0.8 μL，下游引物 (5 μmol/L) 0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。每个样本3组重复。

使用Fastp软件对原始测序序列进行质控。使用FLASH软件对筛选的双端序列进行配对拼接，使用USEARCH (version 7.0) 根据97%的相似度对序列进行OTU聚类并剔除嵌合体。利用RDP Classifier对每条序列进行物种分类注释，最后比对Silva 16s rRNA数据库 (v138) 对每个OTU的身份序列进行分配^[21]。使用Qiime (1.9.1)^[22]计算包括样品覆盖率 (Coverage percent)、种群丰富度指数 (Chao、ACE) 以及群落多样性指数 (Shannon 和Simpson) 在内的α-多样性参数以及对OTU表进行组间差异性分析，主要进行门水平群落多样性分析。

使用LIVE/DEAD™ BacLight™ Bacterial Viability Kit (L7012) 测定混凝土表面生物膜中细菌的活力。L7012中含1小瓶SYTO 9核酸染色剂 (300 µL，在DMSO中为3.34 mmol/L) 和1小瓶碘化丙啶 (300 µL，在DMSO中为20 mmol/L)。SYTO 9的激发波长和发射波长分别为485和500/32 nm，能使活细胞呈现绿色荧光。PI的激发波长和发射波长分别为561和617/40 nm，能使死细胞呈现红色荧光。首先，将取回的混凝土试块用蒸馏水冲洗掉表面的砂砾、贝壳等杂质，使其表面无残余的未结合颗粒；其次，将SYTO 9试剂和PI试剂进行混合 (体积比1∶1)；然后将混合液加入到混凝土表面选定的区域，室温下染色15 min；最后，用无菌水冲洗样本表面的多余染料，在OLYMPUS FV1000共聚焦激光扫描显微镜 (CLSM) 下观察混凝土表面。对每组的3块混凝土分别拍摄5组CLSM图像，使用ImageJ软件分别对活/死细胞两种不同荧光照片进行细胞粘附面积百分比进行统计分析。

在混凝土试块上选取尺寸10mm×10mm的小试块，经干燥和喷金过程后，使用Zeiss Merlin compact SEM观察表面微观形貌。同时使用Oxford Xmax EDS分析混凝土表面化学元素。

图1为在海洋潮汐区暴露不同时间的混凝土表面照片。可以看出，未涂覆TEOS/IBTS复合涂层的混凝土，在暴露3个月后，表面开始出现颜色变化，同时出现一层沉积状的污秽，6个月后，可看到少量小型藤壶状海洋生物附着。但是，涂覆TEOS/IBTS复合涂层后，混凝土在长达12个月的暴露过程中，表面仅有少量微生物附着。主要原因是，TEOS/IBTS复合涂层改变了混凝土表面的亲水特性，降低了混凝土的表面能，使得海洋微生物不易在混凝土表面附着和生长，同时所具有的自清洁功能，会导致附着的微生物被水流及时冲刷掉，不易产生结垢。

图2是在潮汐区分别暴露3、12个月后，混凝土表面接触角和表面能的变化。从图3中可以看出，涂覆TEOS/IBTS复合乳液后，混凝土在经过3个月的暴露后，表面接触角可以达到114.19°，保持疏水状态；经过12个月的暴露后，表面接触角有所降低，达到103.15°，依然保持疏水状态。但是，未经TEOS/IBTS复合乳液涂覆的混凝土表面，接触角则低于90°，外界水分可在混凝土表面铺展，有利于微生物在表面的附着和生长。另外，课题组前期的研究表明^[18]，经过TEOS/IBTS复合乳液处理的混凝土表面，即使磨损5~8 mm后，混凝土表面仍然具有较高的接触角和较低的表面能，疏水性能良好。因此，其长期疏水性能可以得到保障，有效减轻了微生物对混凝土表面造成的污损现象。

表2是暴露不同时间后，混凝土表面微生物的α-多样性指数，每个样本的细菌序列数被抽平为27656来比较细菌的群落丰富度和物种多样性。表中，KB和TEOS分别代表的是未涂覆与涂覆TEOS/IBTS复合乳液的混凝土；3、6、9、12分别代表暴露时间为3、6、9、12个月。

从Coverage指数可以看出，细菌群落的覆盖度最低为96.4%，说明该数据已经高度覆盖了每个样品中的细菌OTU。混凝土表面Sobs的数量由3个月时的220~662，逐渐增多到6个月时的690~1707、9个月时的1714~2630以及12个月时的1929~2874，说明随着暴露时间的增长，混凝土表面由相对简单、均一的微生物群落，逐渐演变成高度复杂的微生物群落。但9和12个月Sobs的数量相差不大，说明9个月后表面的微生物丰富度已接近饱和。从表中还可以看出，涂覆TEOS/IBTS复合乳液后，混凝土表面的Sobs数量均低于未涂覆试块，说明TEOS/IBTS复合涂层有效抑制了海水中微生物的附着。

Chao、ACE指数是估计微生物丰富度的重要指标。由表4可以看出，不同暴露时间下，TEOS/IBTS复合涂层降低了混凝土表面细菌的Chao值和Ace值，说明TEOS/IBTS复合涂层不但可以减少微生物的附着量，且不利于微生物的生长繁殖。在暴露相同时间下，水灰比较高的混凝土样品其Chao值和Ace值较高，这是因为高水灰比导致的高孔隙率，增加了渗透性，混凝土更易受到微生物污损^[23,24]，也更应该进行防护处理。

Shannon值和Simpson值表示样品中微生物的多样性，Shannon值越大，同时Simpson值越小，说明样品中细菌群落的多样性越高。从表中可以看出，随着暴露时间延长，Shannon值不断增加，而Simpson值减小，说明混凝土表面细菌群落的多样性呈现增大的趋势，细菌群落结构逐渐均匀和完整。但是，表面经TEOS/IBTS复合涂层处理后，Shannon值有所降低，说明TEOS/IBTS复合涂层导致混凝土表面细菌群落的多样性有所降低。另外，当混凝土水灰比较高时，其表面Shannon值较大，表明高水灰比混凝土对生物污垢的敏感性较高^[23,24]。

图3是混凝土表面微生物在门水平上的群落组成。可以看出，两种水灰比的混凝土表面主要细菌类群 (至少在一个样本相对丰度1%) 门级数量相似，但门级成分有所差异。混凝土表面有12个相同细菌菌门，主要包括变形菌门 (Proteobacteria)、拟杆菌门 (Bacteroidota)、蓝细菌门 (Cyanobacteria)、放线菌门 (Actinobacteria)、酸杆菌门 (Acidobacteriota)、绿弯菌门 (Chloroflexi)、浮霉菌门 (Planctomycetota) 等。当暴露时间为3个月时，Proteobacteria和Bacteroidota为主要优势菌门，但当暴露时间增加到6个月时，两种优势菌门的相对丰度逐渐降低。

在水灰比较低的混凝土表面，当暴露时间为6个月时，出现了脱硫细菌门 (Desulfobacterota)、厚壁菌门 (Firmicutes) 两种已被证实会对混凝土造成腐蚀的菌门^[25-27]。其中，Desulfobacterota的相对丰度在涂覆TEOS/IBTS复合乳液的混凝土表面较高 (2.70%)。但是，当暴露时间增加到9个月时，其相对丰度下降至0.18%，12个月后为0.30%。当暴露时间为12个月时，Firmicutes在空白组试样表面相对丰度为1.18%，但在涂覆TEOS/IBTS复合乳液的混凝土表面相对丰度太低可以忽略不计。另外，TEOS/IBTS复合涂层明显降低了Proteobacteria、Bacteroidota、Cyanobacteria、Actinobacteria这几种优势菌门在混凝土表面的相对丰度。

在水灰比较高的混凝土表面，当暴露时间为3个月和6个月时，优势菌为Proteobacteria，在涂覆TEOS/IBTS复合乳液的混凝土表面相对丰度高于空白试样，分别为73.98%和47.57%；但是，从9个月开始，其相对丰度降低，12月时，相对丰度下降至31.84%，低于空白试样表面 (37.93%)。而对于易造成混凝土腐蚀的Desulfobacterota，当暴露时间为12个月时，涂覆TEOS/IBTS复合乳液的混凝土表面相对丰度 (0.38%) 相比空白试样表面相对丰度 (1.75%) 有所降低，降低了78.51%。

综合来看，TEOS/IBTS复合涂层影响了混凝土表面微生物组成，对某些海洋微生物的生长繁殖有一定的影响。随着暴露时间的延长，微生物群落的结构在不断发生变化，TEOS/IBTS复合涂层有效减少了Desulfobacterota、Firmicutes等造成混凝土腐蚀细菌的附着，明显改善了混凝土表面的细菌群落结构。

图4为混凝土表面生物膜的CLSM图像，利用荧光染料区分了活细胞和死细胞。可以看出，当混凝土表面未经TEOS/IBTS复合涂层处理时，活/死微生物从均匀分布逐渐发展到密集状态，且呈团聚状，形成大面积的微生物膜。经TEOS/IBTS复合涂层处理后，活/死微生物分布则较为松散，没有形成大面积的微生物密集。

从图5的统计结果可以看出，TEOS/IBTS复合涂层降低了混凝土表面附着的死细胞的数量，主要是因为混凝土表面能低，受到海水冲刷后，死细胞极易从表面脱落，减少了表面的生物污垢。而且，涂覆TEOS/IBTS复合涂层后，混凝土表面细胞粘附面积百分比始终较低，暴露时间为3、6、9、12个月时，混凝土表面抗粘附性能分别提高了85.59%、88.12%、89.04%、94.85%。因此，TEOS/IBTS复合涂层由于其良好的疏水性能，减少了海洋微生物在混凝土表面的粘附，抑制了微生物膜的形成。

图6为暴露3、12个月后，水灰比为0.4的混凝土表面微观形貌。从图6a和c中可以看出，当混凝土表面未涂覆TEOS/IBTS复合乳液时，暴露3、12个月后，混凝土表面微观结构呈疏松多孔的状态，且存在细小的微裂纹。但是，当混凝土表面涂覆TEOS/IBTS复合乳液后 (图6b和d)，表面密实度增加，出现大量针状产物。

TEOS/IBTS复合乳液与混凝土表面之间通过形成Si—O—Si键构建牢固的疏水涂层^[18]，使微生物不易在混凝土表面附着与生长，与此同时，TEOS/IBTS复合乳液还可以与水泥水化产物Ca(OH)₂发生二次水化反应，形成针状C—S—H凝胶 (图6)。针状的二次水化产物增加了混凝土表面的粗糙度，根据超疏水Cassie理论，在疏水物质的表面增加其粗糙度，可进一步提高材料表面的疏水性能，使其达到超疏水效果。因此，在TEOS/IBTS复合涂层作用下，海水不易浸湿混凝土表面，同时抑制了海水中微生物在混凝土表面的附着与生长，即使有微生物在混凝土表面附着，在水流作用下，也很容易被冲刷掉，提高了混凝土的抗生物污损性能 (图7)。

以异丁基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯为原料，采用溶胶凝胶法制备了TEOS/IBTS复合乳液，并在混凝土表面形成TEOS/IBTS复合涂层。TEOS/IBTS复合涂层提高了混凝土表面接触角。长时间实际海洋环境暴露后，混凝土表面疏水性保持良好，有效防止了海洋污损微生物的附着和生长。TEOS/IBTS复合涂层降低了混凝土表面的细菌群落结构丰富度和物种多样性指数，特别是降低了对混凝土具有腐蚀性的Desulfobacterota和Firmicutes等细菌的物种丰度，改善了混凝土表面的细菌群落结构。TEOS/IBTS复合涂层提高了混凝土表面的致密度，在降低表面能的同时增加了混凝土表面的粗糙度，使其拥有良好的疏水性能，进一步抑制了海洋微生物对混凝土表面的污损。