1 前言

对于高效隔离高放射性废物，国际上普遍认同采取多重屏障的深地质处置方式，即将高放射性废物玻璃固化后，装入金属、混凝土容器，再将其置于地下深部的基岩硐室中，同时回填以膨润土等缓冲材料^[1]。针对高放废物容器的选材，各国依据具体条件选择不同的材料，而Cu被芬兰、瑞典、西班牙和日本等国拟选作为双层结构容器的外包装层^[2]。紫铜因导电导热性好、耐腐蚀性好、延展性好而被广泛应用于各行业^[3,4]，作为金属包装容器的预选材料理论上具有一定的可行性。

微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其中的菌群种类多样，数量繁多。不同的土壤环境微生物群落结构和功能不同，代谢类型差异较大^[5,6]。放线菌是土壤环境中的一大类菌群，代谢过程中产生大量的初级及次级代谢产物^[7,8]。目前为止，微生物引起材料腐蚀的相关报道很多，已经证实处于海洋环境^[9]-[11]、土壤环境^[12]-[14]和大气环境^[15]中的金属，能够受到所处环境中微生物的腐蚀。微生物通过生物膜等机制附着于金属表面，代谢过程中分泌的有机酸等代谢产物会促使金属发生电化学腐蚀^[12]，进而影响材料的腐蚀进程。虽然此方面的研究较多，但在某些特定环境中微生物腐蚀并未得到深入研究。

核辐射会给动植物带来毁灭性的灾难，而微生物的活动，会加速材料的腐蚀，进而缩短使用寿命，严重者甚至导致泄露。就高放废物处置库的环境而言，目前已对高放废物处置预选场址的水文地质条件进行了深入研究，但该地区微生物对金属材料Cu的影响目前还处于空白。因此本文以金属材料紫铜为主体，研究高放废物处置预选场址区土壤中优势放线菌菌群对其的腐蚀影响。

2 实验方法

实验所用菌群分离于高放废物处置预选场址区的土壤，富集及培养所用的培养基成分为：淀粉10 g，酪素0.3 g，KNO₃ 2 g，K₂HPO₃ 2 g，MgSO₄7H₂O 0.5 g，CaCO₃ 0.02 g，FeSO₄7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL。用NaOH调节pH值至7.2。培养后的菌种于4 ℃冰箱中保存，备用。实验前菌种活化24 h。

实验材料为紫铜，化学成分 (质量分数，%) 为：Cu 98.86，Al 0.08，Ca 0.26，P 0.02，S 0.02，Si 0.76。铜板切割为10 mm×10 mm×2 mm片状，水磨砂纸逐级打磨 (400，1000，500，2000＃) 后，分别用乙醇、丙酮、蒸馏水浸泡超声15 min，除污除油后吹干，于超净工作台上紫外灯下灭菌20 min，备用。

腐蚀体系为4个铜片浸没在含100 mL培养基的250 mL锥形瓶中，其中有菌组中加1 mL活化24 h菌液，于摇床上恒温震荡培养 (35 ℃，110 N) 2，9，30和60 d。在浸泡天数为2，9和30 d时，给对照组及处理组中分别添加10 mL的5.5倍高浓度培养基，以维持菌群持续生长状态。实验过程中，间隔一定时间用平板菌落计数法统计腐蚀体系中的活菌数。

试样用乙醇、丙酮、蒸馏水依次洗脱表面的腐蚀产物，电吹风冷风吹干。用ULTRA55场发射扫描电子显微镜 (FE-SEM) 观察样品表面腐蚀形貌，并用其自带的Oxford IE450X-Max80能谱仪 (EDS) 进行元素表征。用CHI760c电化学工作站于25 ℃下进行电化学测试。三电极测试系统，其中工作电极为Cu，电极工作面积为1 cm²，其余部分用环氧树脂密封；辅助电极为Pt电极；参比电极为饱和甘汞电极。电解液为2%NaCl溶液。极化曲线扫描范围相对开路电位±1 V，扫描速率为10 mV/s；电化学阻抗 (EIS) 激励信号为5 mV的正弦波，测试频率范围为10 mHz~100 kHz。测量结果用ZView2软件拟合。

3 结果与讨论

3.1 放线菌菌群生长情况

接菌培养基中放线菌菌群活菌数随时间变化见图1。放线菌能在pH值为7.0~7.6的范围内生存，将活化24 h的放线菌菌液添加到培养基中可以快速进入对数生长期。在浸泡2，9和30 d后添加高浓度培养基，腐蚀周期内活菌数维持在一定水平，最大可达到3.9×10⁷ cellmL^-1。浸泡0~9 d，活菌数呈现指数上升趋势，之后进入稳定期。浸泡30 d后添加高浓度培养基，菌群活菌数有一个小幅回升。由于腐蚀体系中营养物质不断消耗，腐蚀产物不断积累，pH值由7.2逐渐增大为7.83，造成后期活菌数一定程度上的下降。

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图1   放线菌菌群活菌数随时间的变化曲线

Fig.1   Actinomycetes number as a function of time

3.2 紫铜表面腐蚀形貌分析

图2和3分别为紫铜在培养基中浸泡9和60 d后的腐蚀形貌。可以看出，两组试样腐蚀形貌差别较大。浸泡9 d时无菌组 (图2a) 表面非均匀分布，腐蚀产物覆盖的区域表面较光滑，产物脱落的地方则呈现蜂状小孔；有菌组 (图2c) 表面覆盖一层完整致密的生物膜。EDS (图2b和d) 结果表明，两组试样均含C，O和Cu 3种元素，但有菌组的C比重明显高于无菌组，主要来源于菌体及其代谢产物。说明含放线菌菌群的体系中，较无菌组优先在紫铜表面形成一层生物膜，以利于其生长繁殖，进而影响腐蚀进程。

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图2   紫铜在无菌与有菌培养基中浸泡9 d后的腐蚀形貌及EDS结果

Fig.2   SEM images (a, c) and EDS results of points A (b) and B (d) of copper after immersion for 9 d in the sterile (a, b) and inoculated (c, d) media

浸泡60 d时 (图3)，有菌组紫铜表面仍然覆盖一层生物膜，但膜层很薄甚至破裂，且蚀坑明显大于无菌组，蚀坑宽度居于0.9~5.1 μm之间，说明放线菌菌群促进紫铜表面形成小孔腐蚀。蚀坑内 (图3c中E点) Cu相同处峰位点含量发生极大变化，说明表面形貌变化较大且腐蚀产物成分及状态也发生一定变化，致使Cu外层不同轨道电子发生跃迁。

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图3   紫铜在无菌与有菌培养基中浸泡60 d后的腐蚀形貌及EDS结果

Fig.3   SEM images (a, c) and EDS results of points C (b), D (d) and E (e) of copper after immersion for 60 d in the sterile (a, b) and inoculated (c~e) media

有氧碱性环境中，推测无菌组紫铜表面的阳极反应为：

(1)Cu+OH-/2OH-→CuOH/Cu(OH)2↓+e-/2e-

氧气促进阴极反应的进行：

(2)O2+2H2O+4e-→4OH-

而对于有菌环境，阴阳极反应在此基础上更加复杂。放线菌的代谢产物包含胞外高聚物、有机酸和酶制剂等。伴随腐蚀产物的积累，部分官能团与Cu⁺/Cu²⁺形成稳定的配合物，同时活性很强的羧基加速腐蚀电化学的进行。因此有菌环境中，Cu⁺/Cu²⁺除了参与形成其氢氧化物的同时还会形成相应稳定的配合物，进而加速阳极溶解。此外，羧基提供的H⁺会加速阴极反应，为紫铜表面氧浓差局部腐蚀电池等微观腐蚀电池的形成创造条件。即：

(3)—COOH→—COO-+H+

(4)H++OH-→H2O

3.3 极化曲线分析

在无菌和有菌培养基中浸泡不同时间后紫铜的极化曲线见图4。随着浸泡时间的延长，极化曲线整体向右偏移。表1为浸泡不同时间紫铜的极化曲线参数。无菌与有菌组的自腐蚀电位E_corr均增大，但前期无菌组增加率大于有菌组，后期无菌组小于有菌组。说明放线菌的生长繁殖改变了溶液及紫铜表面的电介质环境，影响了腐蚀进程。

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图4   浸泡不同时间无菌和有菌培养基中紫铜的极化曲线

Fig.4   Polarization curves of copper immersed for different time in the sterile (a) and inoculated (b) media

腐蚀电流密度I_corr反映金属腐蚀速率^[16]，腐蚀周期内I_corr随时间的变化曲线见图5。可以看出，放线菌菌群对紫铜的腐蚀行为表现为前抑后促。无菌组I_corr呈现震荡变化，这主要与紫铜表面氧化膜的形成及腐蚀产物的积累有关。有菌组前期的抑制过程主要与活性生物膜及膜内的微环境有关。对照图1，有菌组抑制阶段与放线菌对数期和稳定期相一致。此期间放线菌的数量及活性都较高，在紫铜表面形成较完整致密的生物膜。生物膜具有电负性，排斥培养基中有害负离子进入紫铜表面，同时生物膜内如磷酸盐等物质对膜下溶液pH值变化有缓冲作用，延缓其酸化过程^[12,17]，因此前期主要表现为抑制作用。随着浸泡时间的延长，体系中微生物活菌数的下降和代谢产物的积累，使生物膜持续更新的平衡打破，同时紫铜表面新的氧化膜还未形成。最终使膜内的各种有机及无机产物和溶液本体形成微电池环境，在紫铜表面建立电化学腐蚀条件，加快腐蚀速率。大部分微生物 (如SRB^[18]，NRB^[19]等) 因活性生物膜而延缓腐蚀，但随着腐蚀周期的延长，最终加速腐蚀。放线菌菌群的腐蚀行为与此趋势一致。

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图5   无菌和有菌培养基中紫铜腐蚀电流密度随时间的变化曲线

Fig.5   Corrosion current density of copper in the sterile and inoculated media as a function of time

以腐蚀深度表示腐蚀速率与腐蚀电流密度的关系为^[20]：

(5)Vdepth=3.27×10-3×MIcorrnρ

其中，M为紫铜摩尔质量，g/mol；I_corr为腐蚀电流密度，μA/cm²；n为电极反应方程式中的得失电子数；ρ为紫铜密度，8.9 g/cm³。由此得出不同浸泡时间下紫铜的瞬时腐蚀速率，见图6。

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图6   无菌和有菌培养基中紫铜腐蚀速率随时间的变化曲线

Fig.6   Corrosion rate of copper in the sterile and inoculated media as a function of time

3.4 电化学阻抗分析

图7为紫铜在无菌和有菌环境中浸泡0，2，9，30和60 d的电化学阻抗谱。从Nyquist图和Bode图上得出，两组腐蚀情况均加重，但腐蚀方式及速率不同。无菌组的阻抗半径 (图7a) 表现为震荡变化，但变化幅度在增大。有菌组则不同，阻抗半径 (图7b) 表现为先增加后减小。说明伴随腐蚀产物及生物膜的不断形成与脱落，紫铜表面电介质性质发生了变化。有菌组浸泡9 d时，阻抗半径和阻抗值均为最大，相位角处于高频区，原因为浸泡9 d时有菌组紫铜表面覆盖一层完整致密的生物膜 (图2c)，对基体形成保护层。Bode图 (图7e，f) 中，浸泡0~30 d后，有菌组相位角的峰值较无菌组处于高频区，直到60 d，两者趋于一致。一般认为，相位角处于高频区是抑制腐蚀的表现。这表明实验前期放线菌菌群对紫铜的腐蚀表现为抑制作用，但随着浸泡时间的延长最终加速腐蚀，这与腐蚀电流密度测量结果一致。

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图7   浸泡不同时间无菌和有菌培养基中紫铜的EIS谱

Fig.7   Nyquist (a, b) and Bode (c~f) plots of copper immersed for different time in the sterile (a, c, e) and inoculated (b, d, f) media

微生物环境中，紫铜表面存在腐蚀产物及生物膜形成的膜层。用等效电路R_s(C_f[R_f(C_dlR_ct)])(图8) 拟合电化学阻抗谱 (图7)。其中，R_s为工作电极和参比电极间电解质溶液电阻，R_f代表生物膜和腐蚀产物膜的电阻，C_f代表生物膜和腐蚀产物膜的电容，R_ct代表电极表面反应的电荷转移电阻，C_dl代表电极表面的双电层电容。利用电化学阻抗分析软件ZView2对等效电路进行拟合，得到相应电化学参数，见表2和3。

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图8   用于阻抗谱拟合的等效电路模型

Fig.8   Circuits model used to fit EIS data: R_s(C_f[R_f(C_dlR_ct)])

无菌组浸泡30 d之前R_f先增加后降低，同时C_f也随着先增大后减小。说明紫铜表面的腐蚀产物层先增厚，随浸泡时间的延长而被破坏。有菌组则不同，浸泡2和9 d的R_f和C_f值逐渐增加但低于0 d的。这是由于放线菌处于指数生长阶段，营养物质大量消耗的同时还没有积累过多的有害离子等腐蚀产物；此外，紫铜表面逐渐开始形成完整的生物膜，此时完成膜层的充、放电过程较容易。

有菌组浸泡9 d时，C_dl值明显偏小，主要是紫铜表面完整的生物膜为放线菌提供了优越的环境，使基体表面的双电层需要阻碍的有害离子少且充放电过程容易。浸泡30 d时C_dl值增加，则可能是由于紫铜表面腐蚀产物层及生物膜层的不均匀脱落，引起基体表面双电层变化以致其电容性增加。此时的R_ct开始急剧下降，这主要是由紫铜表面的腐蚀小孔引起的^[16]，说明此刻有菌组紫铜表面已经处于蚀坑形成的初级阶段。结合阻抗谱分析得出，放线菌存在时，紫铜表面电介质改变，引起的电化学腐蚀不同于无菌组。与极化曲线变化趋势一致，放线菌存在时，对紫铜的腐蚀行为表现为前期抑制，后期逐渐加速腐蚀。

4 结论

(1) 添加高浓度培养基可以维持放线菌菌群一定周期内持续生长，提供60 d的腐蚀体系。

(2) 浸泡9 d时，放线菌菌群在紫铜表面形成完整的生物膜，微生物促进蚀坑的形成，进而影响腐蚀进程。

(3) 极化曲线分析表明，前期有菌组腐蚀速率小于无菌组的，表现为抑制作用。随着时间的延长，后期腐蚀速率增大，表现为促进腐蚀。

(4) EIS分析表明，放线菌菌群对紫铜的腐蚀表现为电化学腐蚀，主要是改变金属表面双电层的结构及性质，进而加速腐蚀。