中国腐蚀与防护学报(中文版)  2018 , 38 (2): 174-182 https://doi.org/10.11902/1005.4537.2017.147

研究报告

杀鱼假交替单胞菌对模拟海水流动环境下Q235碳钢腐蚀的抑制行为

叶赛12, MasoumehMoradi2, 宋振纶2, 胡方勤2, 孙朝晖2, 龙剑平1

1 成都理工大学材料与化学化工学院 成都 610059
2 中国科学院宁波材料技术与工程研究所 中国科学院海洋新材料与应用技术重点实验室 宁波 315201

Inhibition Effect of Pseudoalteromonas Piscicida on Corrosion of Q235 Carbon Steel in Simulated Flowing Seawater

YE Sai12, Masoumeh Moradi2, SONG Zhenlun2, HU Fangqin2, SHUN Zhaohui2, LONG Jianping1

1 College of Materials and Chemistry & Chemical Engineering, Chengdu University of Technology, Chengdu 610059, China;
2 Key Laboratory of Marine New Materials and Related Technology, Ningbo Institute of Materials Technology and Engineering, Chinese Academy of Sciences, Ningbo 315201, China

文献标识码:  TG171

文章编号:  1005-4537(2018)02-0174-09

通讯作者:  通讯作者 龙剑平,E-mail:longjianping@cdut.cn,研究方向为金属腐蚀与防护

收稿日期: 2017-09-9

网络出版日期:  2018-04-20

版权声明:  2018 《中国腐蚀与防护学报》编辑部 《中国腐蚀与防护学报》编辑部

基金资助:  国家自然科学基金 (5161101078),中国科学院院长国际奖学金 (PIFI),浙江省公益项目 (2015C31031) 和宁波市自然科学基金 (2015A610070)

作者简介:

作者简介 叶赛,男,1992年生,硕士生

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摘要

从位于中国东海的钢铁研究总院舟山海洋腐蚀研究所近海海域的海底沉积物中分离提取得到杀鱼假交替单胞菌,分别将其接种到细菌培养广口瓶和模拟海水流动环境培养器中,利用电化学工作站、扫描电镜及红外光谱仪对浸泡于两种培养体系中Q235碳钢样品的腐蚀行为进行研究。结果表明,杀鱼假交替单胞菌能抑制碳钢在海水中的腐蚀进程。样品的阻抗在广口瓶培养体系中得到了更为明显的提高,广口瓶培养体系中的碳钢样品表面覆盖着一层质地均匀且完整的生物膜;而模拟海水流动环境中碳钢样品表面的生物膜厚度不均匀,海水通过膜层上的孔洞和裂隙与未成膜基体直接接触,在生物膜与样品表面之间形成氧浓差微电池使得局部腐蚀得以发展。红外光谱分析结果显示,培养7 d后两个体系中碳钢样品表面的生物膜内细菌的分泌物大分子不同。

关键词: 杀鱼假交替单胞菌 ; 抑制腐蚀 ; 实验室条件培养 ; 模拟海洋流动环境培养 ; 氧浓差电池

Abstract

Pseudoalteromonas piscicida was separated and extracted from seafloor sediments located in offshore waters of Zhoushan institute of marine corrosion at Zhoushan islands of the East China Sea. Then the bacterium was inculated to laboratorial bottle that placed in a constant temperature incubator shaker and to an incubator with environment of simulated lowing sea water, respectively. The effect of Pseudoalteromonas piscicida on the corrosion of Q235 carbon steel in the above two bacterial culture systems has been studied by means of electrochemical workstation, scanning electron microscope and Fourier infrared spectrometer. Results showed that this bacterium could inhibit effectively the corrosion of Q235 carbon steel in seawater. The impedance of the carbon steel was enhanced more obviously in laboratorial bottle and its surface was completely covered with an uniform and dense biofilm, while the uneven biofilm formed on the surface of carbon steel in the simulated flowing seawater system, seawater can direct contact the substrate via holes and crevices which were randomly distributed throughout the biofilm, provided conditions for the formation of oxygen concentration cell, therefore weakened the corrosion resistance of carbon steel. FT-IR spectrum showed there were differences in secretory macromolecules for the same bacterium but cultured respectively in the two culture systems after 7 d.

Keywords: Pseudoalteromonas piscicida ; corrosion inhibition ; laboratorial culturing ; simulated marine environmental culturing ; oxygen concentration cell

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叶赛, MasoumehMoradi, 宋振纶, 胡方勤, 孙朝晖, 龙剑平. 杀鱼假交替单胞菌对模拟海水流动环境下Q235碳钢腐蚀的抑制行为[J]. 中国腐蚀与防护学报(中文版), 2018, 38(2): 174-182 https://doi.org/10.11902/1005.4537.2017.147

YE Sai, Masoumeh Moradi, SONG Zhenlun, HU Fangqin, SHUN Zhaohui, LONG Jianping. Inhibition Effect of Pseudoalteromonas Piscicida on Corrosion of Q235 Carbon Steel in Simulated Flowing Seawater[J]. Journal of Chinese Society for Corrosion and Protection, 2018, 38(2): 174-182 https://doi.org/10.11902/1005.4537.2017.147

随着对海上资源的勘探开发,围绕海洋基础设施建设而开展的研究越来越受到人们的关注,而海洋装备在服役过程中会面临腐蚀所带来的巨大威胁[1,2]。由于海洋微生物的介入,海洋钢结构的腐蚀行为有别于单纯电化学腐蚀而变得更为复杂。对于海洋微生物腐蚀来说,研究得较为深入的有硫酸盐还原菌、铁细菌、产酸菌、产粘泥菌和产氨菌等[3,4]。外界环境会直接影响细菌的代谢过程从而使得微生物对材料表现出截然不同的作用机理。目前,被多数学者普遍接受的海洋或土壤中微生物对于材料腐蚀的主要机理包括:细菌的代谢产物与金属离子发生络合等反应,生成微生物膜促进厌氧菌的繁殖或导致局部氧浓差,细菌的酸性分泌物直接导致材料基体受损,或产生微生物酶如H2O2酶等。这些现象通常加速材料腐蚀[5,6]

海洋中还存在能够抑制金属材料腐蚀的细菌,Moradi等[7]认为Vibrio neocaledonicus sp.对碳钢有明显的缓蚀作用。细菌自身的代谢过程与在金属表面吸附的胞外聚合物[8]被认为是抑制腐蚀的关键所在。探究细菌如何抑制碳钢腐蚀可为开发绿色缓蚀剂[9,10,11]打下良好的基础。杀鱼假交替单胞菌 (Pseudoalteromonas piscicida) 在东海广泛分布,研究其对常见Q235碳钢的腐蚀行为具有实际意义。本文将讨论该菌在实验室常用广口瓶培养条件下和在模拟海水流动环境下对Q235碳钢的缓蚀作用所表现出的差异,以及导致该差异的原因。

1 实验方法

1.1 实验材料

Q235钢的化学成分 (质量分数,%) 为:C 0.14~0.22,Si≤0.30,Mn 0.30~0.65,S≤0.050,P≤0.045,Cr残余含量≤0.030,Ni残余含量≤0.030,Cu残余含量≤0.030,Fe余量。将Q235钢加工制成15 mm×15 mm×5 mm的块体;用焊料将铜质导线与试样连通,并密封于充满环氧树脂的圆柱腔体内,仅露出工作面,如图1所示。使用240,400,800,1200,2000#的砂纸依次打磨工作面,并抛光。随后浸入95% (质量分数) 乙醇溶液中超声清除表面残留物,取出以N2吹干后,置于紫外灯下灭菌待用。

图1   工作电极示意图

Fig.1   Schematic diagram of work electrode

细菌采集于舟山海域近岸的海底淤积泥层,分离后通过中国海洋微生物菌种保藏管理中心鉴定为杀鱼假交替单胞菌 (NamePseudoalteromonas piscicida,Strain:IAM12932 (T),Accession:AF297959)。分离提取后细菌保存于-80 ℃待用。细菌的水相培养基由人工模拟海水[12]和碳氮营养源组成。其中模拟海水的具体配方为:NaCl 23.476 g/L,MgCl2·6H2O 10.610 g/L,Na2SO4 3.917 g/L,KCl 0.667 g/L,KBr 0.096 g/L,NaHCO3 0.192 g/L,H3BO3 0.026 g/L,CaCl2·6H2O 0.780 g/L,鱼粉蛋白胨3 g/L作为碳氮营养源。使用1 mol/L的NaOH溶液缓慢调节水相培养基的pH值至7.7±0.1。随后放入高温灭菌锅内加热至121 ℃保温20 min后,取出冷却至室温待用。

将细菌从超低温冰箱中取出后,接种到灭菌水相培养基中,置于振荡培养箱在30 ℃下进行活化培养,6 h后用移液枪将活化后的菌液接种到广口瓶培养系统 (LB) 和模拟海水流动环境培养器 (FS) 中。LB置于30 ℃的振荡培养箱中,震荡频率设定为100 r/min,如图2所示;FS置于30 ℃恒温水浴锅中,蠕动泵频率设定为100 r/min,空气泵进气量为0.945 L/min,如图3所示。

图2   广口瓶培养系统示意图

Fig.2   Diagram of laboratorial bottle culture system

图3   模拟海水流动培养系统示意图

Fig.3   Diagram of simulated marine environmental culture system

1.2 测试方法

实验中电化学数据均使用Autolab电化学工作站 (PGSTAT302N,Metrohm) 测试得到。采用三电极体系[13],其中对电极为Pt电极 (10 mm×10 mm),参比电极为饱和KCl甘汞电极,工作电极为工作表面15 mm×15 mm的Q235碳钢试样。电解质溶液为含菌人工海水。电化学阻抗谱 (EIS) 测定条件为幅值±10 mV的扰动电位,105~10-2 Hz扫描频率。动电位极化曲线扫描起始电位-1.5 V,结束电位1.5 V,扫描速率为0.002 V/s。每次需等待体系稳定10 min后开始电化学测试工作,测试过程中保持温度稳定在 (30±0.5) ℃。样品经过极化测试以后由于外加电压的影响不再用于后续阻抗测试和表面形貌观察。

Fourier红外光谱仪 (Cary660,Agilent) 用于样品表面所吸附的生物膜内特征官能团红外吸收光谱 (FT-IR) 检测。将放入水相培养基内一定时间周期后的碳钢样品取出,N2缓慢吹干工作面后可直接测定选定区反射光谱,在此之前需要准备浸泡于无菌模拟海水中的碳钢样品去除背景干扰[14]。FT-IR扫描范围为4000~700 cm-1,扫描次数为32,分辨率2 cm-1

碳钢样品在两种培养系统中培养一定时间后取出,用无菌注射用水缓慢冲洗掉表面不稳定的附着物,接着浸入2% (质量分数) 戊二醛溶液中4 h以固定样品表面细菌,取出后依次浸入50% (质量分数) 和98%的乙醇溶液中进行10 min梯度洗脱,N2吹干后在场发射扫描电镜 (FESEM,FEIQuantaFEG250) 下对样品表面形貌进行观察[15]。对选定区域的具体成分使用能谱仪 (EDS,Oxford instrument 50 mm2 X-Max) 进行定量分析。

2 结果与讨论

2.1 电化学测试结果

2.1.1 电化学阻抗谱 图4为Q235碳钢样品在无菌与含菌LB和FS中浸泡不同时间周期后的Nyquist图和Bode图。图5是对阻抗曲线进行拟合后的等效电路[16,17]。其中,Rs代表溶液介质电阻,Rct为电荷传递电阻,Rb代表微生物膜电阻,Rof代表样品表面腐蚀氧化产物电阻,CPEdl表示双电层电容,CPEb代表微生物膜电容,CPEof代表氧化产物电容。拟合得到的相关电化学参数见表1。比较图4a和b与c和d能够观察到,碳钢在无菌海水中阻抗值随浸泡时间延长无显著变化,基体的耐蚀性没有提高;含菌人工海水的LB与FS中的阻抗弧半径随样品浸泡时间的延长而逐渐变大,圆心上移,有了明显的增大趋势。从图4e和f与g和e中可以看出,有菌海水中样品的幅角值最大,说明电容性最强;而试样在无菌海水中的幅角值更小,电容性很差,对应的极化电阻也很小,耐蚀性不好。这是由于碳钢在有菌条件下初始氧化层上方再覆盖一层生物膜,使得电极表面粗糙度降低且电场分布均匀[18],所对应的RctRb均有一个增长的趋势,且细菌在经过一定生长代谢过程以后大量分泌胞外聚合物 (EPS) 覆盖试样表层的氧化膜使容抗弧模值持续变大,进而阳极腐蚀进程减缓,整体表现出缓蚀特性[19]。比较图4c和g及d和h及对应的电化学参数可知,碳钢样品在LB中浸泡24 h以后Rct的增幅远远高于FS中的,Nyquist图圆心上移较FS也更为明显,这表明细菌在LB中迅速生成了完整均匀的生物膜覆盖试样工作面,有效阻止了阳极上电子交换过程,缓蚀效果更为显著。

图4   Q235 碳钢在无菌与含菌LB和FS中的Nyquist图和Bode图

Fig.4   Nyquist (a~d) and Bode (e~h) plots of Q235 carbon steel immersed in LB (a, c, e, g) and FS (b, d, f, h) without (a, b, e, f) and with (c, d, g, h) bacteria

图5   Q235碳钢在无菌与含菌LB和FS中浸泡不同时间后EIS的等效电路图

Fig.5   Equivalent circuits of EIS for Q235 carbon steel after immersion in LB and FS without and with bacteria for 0 h (a) and in LB (b) and FS (c) for 1~14 d, respectively

表1   Q235碳钢在LB和FS中浸泡不同时间后的电化学阻抗谱拟合参数

Table.1   Impedance parameters of Q235 carbon steel after immersion in LB and FS without and with bacteria for different time

ConditionRs
Ωcm2
Rct
kΩcm2
Rof
Ωcm2
Rb
Ωcm2
CPEdl
μFcm-2
CPEof
μFcm-2
CPEb
μFcm-2
LB/0 h(sterile)1.580.511------1.9------
LB/0 h(bacterial)3.142.136------12.5------
LB/1 d(sterile)3.390.79445.6---32.678.6---
LB/1 d(bacterial)1.6312.5378.589.123.764.336.5
LB/3 d(sterile)8.470.266170.1---31.898.8---
LB/3 d(bacterial)7.6412.76265.6212.456.267.376.8
LB/7 d(sterile)2.890.601335.6---71.4109.4---
LB/7 d(bacterial)0.8113.36677.3376.232.454.2155.4
LB/14 d(sterile)1.870.234403.8---53.267.6---
LB/14 d(bacterial)2.3128.96765.2579.636.6121.796.8
FS/0 h(sterile)3.910.975------4.6------
FS/0 h(bacterial)3.231.843------6.7------
FS/1 d(sterile)4.290.42254.3---22.765.3---
FS/1 d(bacterial)5.452.26432.356.216.277.622.9
FS/3 d(sterile)3.230.608107.4---63.289.2---
FS/3 d(bacterial)2.872.44949.3128.310.534.613.4
FS/7 d(sterile)2.130.701154.2---67.483.5---
FS/7 d(bacterial)1.125.12278.8107.617.328.956.7
FS/14 d(sterile)6.650.495275.4---43.990.7---
FS/14 d(bacterial)3.458.74372.5316.516.643.849.5

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2.1.2 极化曲线 图6为碳钢样品在无菌与含菌LB和FS中浸泡不同时间后的动电位极化曲线,得到的电化学参数见表2。从图6a和b与对应的极化曲线拟合数据中可以看出,无论是在LB还是FS中,有菌条件下样品的腐蚀电流密度都低于无菌环境中的,证实了杀鱼假交替单胞菌对碳钢腐蚀的抑制作用。在LB中,相较于浸泡1 d的试样,在微生物的作用下7 d以后电极自腐蚀电位Ecorr正移,腐蚀电流密度Icorr从35.91 μA·cm-2下降到11.62 μA·cm-2,钝化区间逐渐变宽[20];随着浸泡时间延长到14 d以后,试样的Icorr进一步减小至4.16 μA·cm-2,Ecorr正移至-0.714 V。对应的物理模型为试样表面覆盖均匀的生物膜,内层则为致密的氧化膜[21],其下的碳钢基体没有产生严重的点蚀或大面积的均匀腐蚀,碳钢样品耐蚀性的增强主要与生物膜有关[22,23]。在FS中,浸泡7 d以后样品的Ecorr和浸泡1 d相比基本保持不变,Icorr从49.33 μA·cm-2下降至31.62 μA·cm-2;浸泡14 d后,Ecorr右移明显,Icorr继续降低至11.67 μA·cm-2。对应的物理模型为FS中随着浸泡时间的延长,碳钢表面最外层分布着不均匀的生物膜,在生物膜与未被覆盖的基体与氧化物之间会形成氧浓差电池,加速局部微区腐蚀,在整体上削弱了碳钢的耐蚀性[24]。在-0.4~-0.2 V附近出现的波谷,是由于在FS中基体某些区域未受到保护而产生的腐蚀产物在此电位上出现钝化作用并迅速过钝化,而LB中由于基体完整未产生大量腐蚀产物所以对应区域无明显钝化区[25]。对比两者的极化曲线可知,在相同的浸泡时间内,试样在LB中的耐蚀性要好于FS中的,这与细菌在两种体系中代谢能力与生成生物膜的快慢存在联系[11],应结合生物膜的表面形貌与红外吸收光谱进行分析。

图6   Q235碳钢在无菌和含菌LB和FS中浸泡不同时间后的极化曲线

Fig.6   Polarization curves of Q235 carbon steel immersed in LB (a) and FS (b) with and without bacteria for 1 and 14 d (b), and in LB and FS with bacteria for 1, 7 and 14 d (c)

表2   Q235碳钢在LB和FS中浸泡不同时间后的极化参数

Table 2   Potentiodynamic polarization parameters of Q235 carbon steel after immersion in LB and FS for different time

ConditionEcorrVIcorr
μAcm-2
βc
mVdec-1
βa
mVdec-1
Rp
kΩcm2
Corrosion rate
mma-1
LB/1 d(sterile)-0.92826.74-78.899.20.192.87
LB/1 d(bacterial)-0.90735.91-69.6176.50.361.89
LB/7 d(bacterial)-0.82111.62-75.9189.61.190.27
LB/14 d(sterile)-0.86639.92-86.9114.60.521.96
LB/14 d(bacterial)-0.7144.16-92.3191.32.450.09
FS/1 d(sterile)-0.88556.38-43.489.60.463.23
FS/1 d(bacterial)-0.91349.33-366.3120.10.243.54
FS/7 d(bacterial)-0.90531.62-39.2115.80.782.79
FS/14 d(sterile)-0.98455.81-75.8176.20.282.15
FS/14 d(bacterial)-0.81511.67-54.1166.41.670.97

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2.2 表面形貌

图7a~h为Q235碳钢在LB和FS中浸泡7和14 d后表面的SEM像。在浸泡7 d后,从图7a中可以看到,LB中的碳钢表面被一层均匀的生物膜所覆盖。从放大图 (图7b) 中能观察到分散在生物膜内的细菌,生物膜致密。图8a为SEM像对应的EDS结果,可以确定碳钢表面所覆盖的膜为细菌胞外聚合物所团聚形成的生物膜。从图8c可以看出,FS中样品表面的生物膜厚度不均且有很多裂隙和孔洞,这为点蚀和微区电池的形成提供了条件[26]。从放大图 (图8d) 上不能明显看到细菌,表面上为氧化物和生物膜混合形成的膜体,这是因为在海洋模拟体系中样品表面会受到水流的冲刷使得初期附着力不够的细菌脱落,且生物膜未完全覆盖表面,相反基体的腐蚀产物占据了上表面。图8b说明表面膜中含有细菌的代谢产物。浸泡14 d后,从图8e和f中可以看出,LB中的碳钢样品表面生物膜形貌较7 d时没有发生明显变化,细菌与自身分泌的大分子物质相结合使膜厚有所增加。从图8g和h中可以看出,FS中碳钢表面的生物膜较7 d时更为均匀,且随浸泡时间的延长细菌寄存于牢固附着的生物膜中清晰可见,但生物膜仍是明显的裂隙和多孔构造。

图7   Q235碳钢在LB和FS中浸泡7和14 d后的SEM像

Fig.7   SEM images of Q235 carbon steel after immersion in LB (a, b, e, f) and FS (c, d, g, h) for 7 d (a~d) and 14 d (e~h)

图8   Q235碳钢在LB和FS中浸泡7 d后表面SEM像及对应的EDS分析结果

Fig.8   SEM images (a, c) and corresponding EDS results (b, d) of Q235 carbon steel immersed in LB (a, b) and FS (c, d) for 7 d

2.3 红外光谱测试

图9a和b分别为浸泡在LB和FS中7和14 d以后Q235碳钢表面生成的生物膜及其它氧化代谢产物的FT-IR谱。从图9a可知,浸泡7 d后,LB和FS均在3400 cm-1附近 (3700~3000 cm-1为羟基和氨基的叠加吸收区) 有—OH的伸缩振动吸收峰;在1623 cm-1附近对应蛋白质酰胺I带C=O的特征吸收峰;在1552 cm-1附近对应酰胺II带的N—H和C—N的特征吸收峰;酰胺I和II特征峰的出现都说明在FS和LB中浸泡后的样品表面均有蛋白质生成。1363 cm-1附近对应着—CHO的伸缩振动峰;在1108和1024 cm-1附近对应的则是C—O的伸缩振动峰,这表明有多糖类物质存在[27]。在LB中,有1228,916和742 cm-1 3种异于FS的特征峰出现;其中1228 cm-1对应蛋白质酰胺III带C—N的伸缩振动峰;916 cm-1对应多糖类环振动吸收峰;742 cm-1对应油脂类的—(CH2)n—平面摇摆振动吸收峰。从这3种特征峰可以看出,在浸泡7 d后,LB和FS中的细菌分泌的大分子有所不同。分析图9b可知,浸泡14 d后LB中各物质对应的吸收峰强度有明显的升高,这表明LB中的细菌代谢产物总量要大于FS中的。14 d后FS中代谢产物在2933和1725 cm-1附近有新特征峰出现,其中2933 cm-1对应的是次甲基—CH2反对称伸缩振动吸收峰,1725 cm-1附近对应羟基C=O的伸缩振动吸收峰,这说明有新的脂类物质产生。综上所述,细菌在经过7 d的培养周期后在LB中分泌出不同于FS中的蛋白质、多糖和油脂类物质,这可能导致样品表面最终形成的生物膜性质的改变,从而影响LB与FS中样品的耐腐蚀性能。在14 d后LB中代谢产物的总量明显高于FS中的,这与上述SEM像的分析结果吻合,LB样品表面被生物膜完全覆盖且生物膜完整致密,而FS中生物膜裂隙密集且局部不均匀分布。

图9   Q235碳钢在LB与FS中浸泡7和14 d后表面生物膜的FT-IR谱

Fig.9   FT-IR spectra of the biofilms formed on Q235 carbon steel after immersion in LB and FS contains artificial seawater with bacteria for 7 d (a) and 14 d (b)

3 结论

(1) 杀鱼假交替单胞菌无论在静态的广口瓶还是在模拟流动环境海水培养系统中,对碳钢样品的容抗弧模值都有不同程度的提升,自腐蚀电位右移,腐蚀电流密度降低,说明杀鱼假交替单胞菌能抑制碳钢在海水中的腐蚀。

(2) 静态的广口瓶中碳钢表面的生物膜更加完整致密,在浸泡初期便完全覆盖基体表面,有效防止了碳钢的腐蚀。模拟海洋流动环境中生物膜分布不均匀,在生物膜与碳钢表面间存在明显的孔洞与裂隙,使得生物膜下金属基体周围的缺氧区成为阳极,富氧部位成为阴极,形成氧浓差电池;阴极反应氧得到电子发生还原生成OH-,阳极反应金属单质失去电子变成金属离子,金属表面亚稳态的微孔迅速生长,造成局部腐蚀,削弱了碳钢的耐蚀性能。LB与FS中EPS的生物大分子存在差异,这可能导致生物膜性质改变,如对金属离子的络合作用减弱,或差异官能团呈现酸性直接导致金属腐蚀,从而导致LB与FS中碳钢样品耐蚀性能产生差异。

The authors have declared that no competing interests exist.


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