1 前言

金属材料浸泡在海水中,微生物会迅速附着,并在材料表面形成一层生物膜。这层生物膜将改变材料的表面状态及周围微环境,如溶氧量、离子浓度和pH值等,从而影响材料的腐蚀行为。通常微生物附着会加速金属构件的腐蚀,如厌氧的硫酸盐还原菌 (SRB),在厌氧环境下,SRB将会大量繁殖并产生黏性物质加速金属的腐蚀。人们对此投入了大量的研究,并提出了SRB加速腐蚀的多种机理^[1,2]。近期,研究人员发现^[3],部分微生物可以抑制碳钢、铝合金和铜合金等的腐蚀。微生物抑制金属腐蚀的机理主要有：微生物的呼吸作用会降低金属表面的氧浓度,从而减缓金属的腐蚀^[4];微生物分泌产物胞外聚合物与金属离子耦合,在金属表面形成致密的生物膜,从而抑制金属的腐蚀^[5]。此外,部分导电性固体材料表面形成的生物膜具有电活性,它们可以将培养基中的电子传递至材料表面,抑制腐蚀的进行^[6]。同一种微生物往往可以抑制多种金属材料的腐蚀,相对于化学缓蚀剂,微生物防腐是一种高效及绿色环保的材料保护方法,因此一些学者提出使用再生生物膜来控制腐蚀的观点^[7],并已在实验室将Al2024、碳钢和弹壳黄铜作为基体进行了研究。但是需要指出的是,生物膜的形成是一个复杂的生物和化学过程,其缓蚀作用往往是通过多种形式共同作用来实现的,因此在将生物膜作为抑制腐蚀性物质前,必须了解微生物抑制金属腐蚀的机理。

本课题组^[8]在前期研究阶段分离出一种新的具有高度缓蚀作用的细菌,经鉴定属于新喀里多尼亚弧菌 (Vibrio neocaledonicus),它可以在碳钢表面形成一层致密的生物膜,从而使其腐蚀速率降低60倍。为了进一步研究该微生物的缓蚀机理,本文选取Cu为研究对象,通过电化学方法和表面分析技术研究了新喀里多尼亚弧菌对Cu在人工海水中腐蚀行为的影响,并讨论了该细菌对Cu的腐蚀抑制作用机理。

2 实验方法

2.1 实验材料

实验中所用材料分为纯Cu和镀铜硅片两种。其中,镀铜硅片采用物理气相沉积法 (PVD) 制备,Cu薄膜厚度为6 μm,用来观察细菌的吸附及生物膜的形成过程。纯Cu样品经水砂纸逐级打磨至2000#后抛光,丙酮脱脂后用蒸馏水清洗,然后在无水乙醇中超声清洗5 min,用N₂吹干备用。实验前将样品浸泡在无水乙醇中,紫外照射灭菌30 min。

2.2 菌种来源及培养

实验所用菌种来源于东海海域,是一种好氧型细菌。采用Axygen基因组DNA提取试剂盒提取纯化培养获得的细菌DNA。利用引物27F和1492R扩增16sRNA基因序列全长,PCR产物连接转化测得序列全长,然后通过细菌模式种网站对比,发现该菌种与Vibrio neocaledonicus (NC470(T)) 相似度最高,达到99.72%,因此,判断该细菌为Vibrio neocaledonicus sp.。

使用修正过的2216e培养基对细菌进行好氧富集培养。培养基成分为人工海水1 L,鱼粉蛋白胨3 g,琼脂20 g。人工海水的成分 (g/L) 为：NaCl 23.476,Na₂SO₄ 3.917,KCl 0.667,KBr 0.096,MgCl₂6H₂O 10.61,CaCl₂6H₂O 1.469,H₃BO₃ 0.026和NaHCO₃ 0.192。将该菌种均匀的涂抹在灭菌后的新鲜培养基中,4 ℃保存于冰箱中备用。使用时先将细菌接种在新鲜的培养基中,放置在30 ℃恒温培养箱中培养1 d,之后按一定比例接种到实验溶液中,即为有菌介质。实验溶液中不含琼脂,其余成分与培养基一致。实验前将实验溶液及实验器材用压力蒸汽灭菌器在120 ℃下高温灭菌15 min,冷却后紫外照射灭菌30 min。

本实验采用比浊法测定细菌的生长曲线,利用紫外分光光度计 (Lambda 950) 测定有菌介质中的光密度 (O.D.) 值来推知菌液的浓度,将所测得的O.D.值与对应的培养时间作图,即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线,本实验选择的波长为600 nm。

2.3 失重实验

试样分别浸泡在无菌介质和有菌介质中密封好,放置在恒温培养箱中培养2,5和10 d。浸泡前称重,浸泡结束后先用去离子水冲洗,然后放在10% (质量分数) H₂SO₄溶液中浸泡3 min以除掉Cu表面的腐蚀产物,酒精冲洗,吹干后称重。

2.4 电化学测试

电化学阻抗谱和极化曲线测试在电化学工作站 (PGSTAT302,Autolab) 上进行,采用三电极体系,辅助电极为Pt电极,参比电极为饱和KCl甘汞电极 (SCE),工作电极为Cu,电极暴露面积为3.125 cm²,非工作面用环氧树脂封装。测试前,将Pt电极、Cu电极及盐桥浸泡在无水酒精中,紫外照射灭菌30 min。电化学阻抗谱 (EIS) 测试扰动电位幅值为±10 mV,测试频率范围为10^-2~10⁵ Hz,极化测试扫描范围为相对开路电位±500 mV,扫描速率为2 mV/s。电化学实验时,在300 mL细口瓶中加入150 mL灭菌的2216e液体培养液,然后接种过夜培养的新喀里多尼亚弧菌作为有菌介质,无菌介质为灭菌的2216e培养液,通过定期更换灭菌培养液来保持无菌环境。将Cu试样浸泡在实验溶液中密封好,放置在30 ℃恒温震荡培养箱中培养,定期进行电化学测试。

2.5 细菌的吸附及生物膜的组成分析

利用激光共聚焦显微镜 (LeiCa TCS SP5) 观察Cu表面的细菌吸附情况。将浸泡在有菌介质中的Cu片取出后,用3 mL/L荧光染色剂SYT09对Cu表面进行染色处理 (SYT09可以穿透细胞壁与DNA结合发出蓝色荧光),避光静置20 min后,用超净水将Cu表面的染色剂冲洗掉,放置在空气中干燥后用于激光共聚焦显微镜 (CLSM) 观察。

将浸泡在无菌介质中的试样取出后,依次用浓度为50%,70%,90%和100%的乙醇脱水15min,然后用N₂吹干,表面喷金,利用扫描电子显微镜 (SEM,Quanta FEG 250) 观察样品表面形貌。样品表面元素含量可用自带的能谱仪 (EDS) 进行分析。有菌介质中浸泡的试样,取出后先放在戊二醛中硬化2 h,然后经脱水、干燥、喷金后用于SEM观察及EDS分析。

3 结果与讨论

3.1 细菌生长曲线

图1为细菌在培养液中的生长曲线。纵坐标为O.D.值,反映了溶液中细菌的数量,O.D.值越大说明细菌浓度越高。可以看出,细菌数量在前24 h迅速增长,由于开始培养液中的营养丰富,细菌生长繁殖不受底物的限制,此时细菌处于对数生长期。24 h浸泡后,细菌数量维持在一个相对恒定的阶段,处于稳定生长期,直到96 h,依然没有进入衰落期。为了使培养液中细菌一直处于生命活跃状态且数量大致恒定,选择每72 h更换1/3的培养液。

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图1   新喀里多尼亚弧菌在培养液中的细菌生长曲线

Fig.1   Growth cycle of bacteria in culture medium

3.2 失重实验

Cu的腐蚀速率按下式计算：

V=W-W0ST(1)

其中,V为腐蚀速率 (g/(m²h));W₀为试样浸泡前的质量 (g);W为浸泡后的质量 (g);S为试样面积 (m²);T为浸泡时间 (h)。此外,可以用生物膜保护效率η来表征细菌的缓蚀作用：

η=VbacteriaVsterile(2)

式中,V_bacteria为试样浸泡在有菌介质中的腐蚀速率,V_sterile为试样浸泡在无菌介质中的腐蚀速率。η<1,表明微生物会抑制材料的腐蚀;η>1,表明此时微生物会促进腐蚀^[9]。Cu浸泡在有菌介质和无菌介质中的失重数据见表1。

由表1可知,在无菌环境中,Cu的腐蚀速率随浸泡时间延长而增大,原因是在溶液中有害离子的侵蚀下,Cu表面初始形成的钝化膜逐渐被破坏,使Cu的腐蚀速率变大。在有菌介质中,浸泡2,5和10 d后,η<1,说明微生物对基体具有保护作用。同时还发现,在有菌介质中,Cu在浸泡前后质量变化不大,说明在细菌的保护作用下,Cu表面几乎没有腐蚀。

3.3 电化学测试

3.3.1 开路电位 Cu电极在无菌介质和有菌介质中开路电位随时间的变化曲线如图2所示。可见,在无菌介质中,Cu的开路电位变化较为平稳。在有菌介质中,经过短暂的平稳期,Cu的开路电位即发生了较大程度的负移,浸泡1 d后负移390 mV;在浸泡后期,稳定在-0.7 V附近。Cu电极开路电位的负移是因为微生物的吸附和新陈代谢活动改变了Cu表面的电化学性质。吸附在Cu表面的细菌通过呼吸作用消耗金属表面的溶解氧,从而导致Cu的开路电路负移^[10],1 d后,Cu表面吸附的细菌数量饱和,使Cu的开路电位稳定在约-0.7 V。

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图2   Cu分别在无菌和有菌介质中开路电位随浸泡时间的变化曲线

Fig.2   OCP of copper during immersion in media with and without bacteria

3.3.2 电化学阻抗谱 图3和4分别为Cu在有/无菌介质中的EIS测试结果。从图3a中可看出,在有菌介质中,Cu从浸泡开始到第5 d,其容抗弧直径急剧增大;浸泡至第10 d,Cu的容抗弧直径有所降低,但仍远大于浸泡初始 (0 d) 的容抗弧直径。从Bode图中可以看出,Cu从浸泡开始,其低频区的阻抗模值|Z |及相位角急剧增大,到第5 d,达到最大值,之后略有降低。在无菌介质中,Cu的容抗弧直径、低频区的阻抗模值|Z |及其相位角在浸泡初期均缓慢增大,之后有所降低。

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图3   Cu在有菌介质中浸泡不同时间的EIS谱

Fig.3   EIS plots of copper immersed in the solution with bacteria for different time: (a) Nyquist diagrams, (b) Bode modulus diagrams, (c) Bode phase angle diagrams

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图4   Cu在无菌介质中浸泡不同时间的EIS谱

Fig.4   EIS plots of copper immersed in the solution without bacteria for different time: (a) Nyquist diagrams, (b) Bode modulus diagrams, (c) Bode phase angle diagrams

根据Cu电极的EIS特征,选择图5a所示等效电路对Cu电极在浸泡前及浸泡在无菌介质中的EIS进行拟合,选择图5b对Cu浸泡在有菌介质中的EIS进行拟合。其中,R_s表示溶液电阻,Q_dl为电极表面双电层电容,R_ct表示电极表面电荷传递电阻,R_f为电极表面的膜电阻,Q_f为电极表面膜电容。各参数拟合结果列于表2中,其中,Y₀₁为膜电容,Y₀₂为双电层电容。

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图5   Cu在浸泡前和浸泡在无菌介质中及浸泡在有菌溶液中的等效电路图

Fig.5   Equivalent circuit models of copper immersed in the solutions without (a) and with (b) bacteria

从表2可以看出来,Cu试样浸泡在无菌介质中,其R_ct随浸泡时间的延长而缓慢增大,最后有所降低。这说明在浸泡初期,Cu表面初始形成的钝化膜具有一定的保护作用,减缓了Cu的腐蚀;在浸泡后期,由于有害离子的侵蚀,钝化膜逐渐被破坏,其保护作用消失,Cu的腐蚀速率变大。在有菌介质中,Cu电极从浸泡开始到第5 d,其R_ct由初始的0.86 kΩcm²增大到第5 d的276.2 kΩcm²,约为初始值的321倍;到第10 d,R_ct降低为117 kΩcm²,但依然远大于初始值,且远大于同期下Cu在无菌介质中的表面电荷传递电阻,说明该细菌可以强烈抑制Cu的腐蚀,并且这种抑制作用经历了一个先增强后减弱的过程。

3.3.3 动电位极化曲线测试 图6是Cu浸泡在无菌和有菌介质中不同时间后的动电位极化曲线。在无菌介质中,Cu的腐蚀电流密度变化不大,在浸泡后期,自腐蚀电位负移,说明Cu的耐蚀性变差。Cu在有菌介质中浸泡过程中,浸泡初期,其腐蚀电流密度迅速降低,在第2 d达到最小值;随着浸泡时间的延长,Cu的腐蚀电流密度开始上升,但是,实验结束时Cu的腐蚀电流密度仍然小于同期下浸泡在无菌介质中的,说明新喀里多尼亚弧菌能抑制Cu的腐蚀。这一结果与EIS结果一致。同时还发现,细菌的加入会使Cu的自腐蚀电位降低,说明细菌的加入抑制了阴极反应的进行^[11]。

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图6   Cu分别浸泡在无菌和有菌介质中不同时间后的极化曲线

Fig.6   Polarization curves of copper immersed in media without (a) and with (b) bacteria for different time

3.4 细菌的吸附及生物膜的形成

3.4.1 细菌的吸附 图7为Cu浸泡在有菌介质中1和10 d后的激光共聚焦显微镜图片。从图7a中可以看出,在有菌介质中浸泡1 d后,Cu表面已基本覆满细菌,这会使Cu的开路电位明显负移、阻抗值迅速增大,腐蚀电流密度明显降低。10 d后,Cu表面吸附的细菌已经聚集并形成菌落。

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图7   纯Cu试样浸泡在有菌介质中1和10 d后的CLSM图

Fig.7   CLSM images of copper immersed in the solution with bacteria for 1 d (a) and 10 d (b)

3.4.2 表面形貌分析 图8所示为Cu分别在无菌介质 (图8a) 和有菌介质 (图8b) 中浸泡10 d后的SEM像。可以看出,在无菌介质中,由于溶液中存在高浓度的有害离子,如Cl^-和SO₄^2-等,Cu腐蚀非常严重。在有菌介质中,Cu表面可见吸附的细菌及生物膜,并未见明显的腐蚀产物,Cu表面状态变化不大,这一结果与失重实验结果一致。但是需要指出的是,Cu表面生物膜较少,而CLSM结果显示,Cu表面几乎被细菌所覆盖,这说明,Cu表面吸附的细菌难以形成生物膜。原因可能是细菌与Cu的吸附仅为可逆吸附,Cu表面的细菌处于吸附与脱附的动态平衡中,并不易形成生物膜。

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图8   纯Cu试样分别浸泡在有菌介质和无菌介质中10 d后的SEM像

Fig.8   SEM images of copper after immersion in the solutions without (a) and with (b) bacteria for 10 d

3.4.3 生物膜的形成 图9为镀铜硅片浸泡在有菌介质中不同时间后的SEM像。表3是镀铜硅片分别在有菌和无菌介质中浸泡不同时间后的EDS结果。从图9a中可以看出,镀铜硅片浸泡在有菌介质中后,细菌会附着到铜镀层缺陷处,原因是Cu表面缺陷处容易腐蚀,易产生氢键,在van der waals力、静电作用力及氢键作用下,细菌倾向于吸附在Cu表面缺陷处。随着浸泡时间的延长,细菌胞外产物 (EPS) 会黏附在Cu表面^[12]并形成一层由EPS、细菌及腐蚀产物组成的生物膜。从表3中可知,相对于无菌环境,在有菌介质中浸泡后的Cu表面氧含量降低,说明细菌会减缓Cu的腐蚀。同时还发现,在有菌环境下,Cu表面出现P,N和S等元素,说明这3种元素均是生物源元素。在浸泡1 d后,Cu表面出现P,而此时Cu表面吸附有大量的细菌,表明细菌中P含量较高;在浸泡5d后,Cu表面P含量降低,说明生物膜中细菌数量减少,细菌从生物膜中脱附出去。从图9c可以看出,细菌的脱附使金属表面生物膜变得不均匀,金属表面Cl^-含量也增加,这些都会减弱微生物的缓蚀作用。

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图9   镀铜硅片浸泡在有菌介质中不同时间的SEM像

Fig.9   SEM images of the Cu deposited Si wafer after immersion in the solution with bacteria for 1 d (a), 2 d (b) and 5 d (c)

3.5 新喀里多尼亚弧菌对Cu的腐蚀抑制机理

如图10中的模型所示,在浸泡初期,细菌大量吸附在Cu的表面,这些细菌一方面会消耗Cu表面溶解氧,另一方面作为阻碍层阻碍有害离子如Cl^-向金属表面扩散,从而抑制Cu的腐蚀。由于受到细菌的保护,Cu表面溶解较为缓慢,几乎没有腐蚀,因而缺乏足够的活性中心,此时细菌的吸附多为可逆吸附^[13],EPS因为缺乏足够的配位离子而不会黏附在Cu的表面。随着浸泡时间的增加,Cu表面某些缺陷处被优先腐蚀,细菌及其分泌产物EPS便会牢固吸附至腐蚀产物的表面,并进一步形成生物膜。在浸泡后期,Cu表面氧含量降低,细菌会向氧含量较高的溶液中扩散,导致Cu表面细菌吸附量减少,细菌的保护作用较弱。同时,由于Cu表面的生物膜并不均匀致密,容易形成氧浓差电池,这些将会降低细菌的缓蚀作用。

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图10   细菌在Cu表面附着及生物膜的形成机理

Fig.10   Schematic illustrations of bacterial adhesion and biofilm formation on copper

4 结论

(1) 新喀里多尼亚弧菌可以抑制Cu在人工海水中的腐蚀。在浸泡初期,细菌大量吸附至Cu的表面,对基体起保护作用,从而抑制Cu的腐蚀。

(2) 随着浸泡时间的延长,Cu表面的细菌逐渐向溶液中扩散,细菌的保护作用减弱,同时不均匀的生物膜会产生氧浓差电池,这些都会降低新喀里多尼亚弧菌的缓蚀作用。

The authors have declared that no competing interests exist.