船舶的微生物腐蚀起初并不被人们所重视。近20年来,许多异常快速的腐蚀问题引起了人们的注意,发现微生物腐蚀在船舶上大量存在。Wade等^[1]在2007年报道澳大利亚皇家海军军舰的10 mm船体板在不到1 a的时间内腐蚀穿孔,腐蚀速率达到10 mm/a,这一过程被认为可能是由微生物腐蚀导致的。中、美、加、澳等国海军舰船均在油箱、压载舱、燃气涡轮发动机等部位检测到微生物腐蚀^[2-4]。微生物腐蚀增加船舶航行阻力,增大油耗,缩短船舶使用寿命,增加维护保养费用,严重威胁船舶的安全^[5,6]。

硫酸盐还原菌 (SRB) 作为一类厌氧微生物,在微生物腐蚀中扮有重要角色,大约一半左右的微生物腐蚀都与SRB有关^[7]。脱硫弧菌 (Desulfovibrio sp.) 作为硫酸盐还原菌的典型代表,广泛存在于各种环境中^[8]。溶藻弧菌 (Vibrio alginolyticus) 是一种高耐盐性的好氧菌,广泛存在于海洋、湖泊等环境中。从不同海域 (青岛和三亚),不同浸泡时间 (3和6个月) 的907钢实海挂片腐蚀产物中,使用不同培养基均可分离得到脱硫弧菌与溶藻弧菌。目前国内外对微生物腐蚀的作用及腐蚀机理已有一定的研究,提出了氢化酶和FeS^[9]的阴极去极化理论,生成含磷化合物理论,铁原子直接传递电子理论^[10],生物催化的阴极硫酸盐还原理论^[11]等。其中有大部分集中在实验室培养基介质中单菌株的腐蚀研究^[12,13],但是SRB通常与其它微生物共存,在自然界形成联盟^[14-17]。不同组分和配比的培养基对腐蚀起到了或促进或抑制的作用,且对腐蚀机理和过程有一定的影响,与自然海水中的微生物腐蚀情况有所差异。而单种细菌的电化学腐蚀研究也很难说明多种细菌的协同作用结果。

907钢是90系列舰艇结构专用低合金高强度钢的一种,具有良好的综合力学性能和加工工艺性,以及较低的腐蚀速率和较高的耐压性。目前,关于这一系列材料的腐蚀研究包括微生物腐蚀研究相对较少。研究907钢海洋环境中的微生物腐蚀,对于评定该系列材料耐蚀性,预测使用寿命以及选择防护措施,有重要的理论和现实意义。

本文以船体结构材料907钢为研究对象,以灭菌天然海水为实验介质,研究脱硫弧菌和溶藻弧菌对907钢腐蚀行为的影响,探讨单一及混合菌种对907钢腐蚀行为作用机理。

1 实验方法

1.1 实验材料与试剂

本实验所用材料为907船体结构钢,其化学成分 (质量分数,%) 为：C 0.120, Si 0.790,Mn 1.010, S 0.007,Cu 0.42,Ti 0.05,Cr 0.64,Ni 0.67,P 0.016,Fe余量。907钢线切割制成直径5 mm,厚度5mm的圆柱。试样一面与Cu导线焊接,用以制作电化学实验所需工作电极。采用环氧树脂密封电极,预留一面作为工作面 (工作面积为19.625 mm²)。907钢线切割制成10 mm×10 mm×5 mm的方块试样,用以观察微观腐蚀形貌。907钢加工成直径为10 mm的圆柱,用环氧树脂密封,预留一面,用以测试平均腐蚀速率。每次实验前,所有金属试样首先依次用240~1200#的砂纸打磨,再经蒸馏水冲洗,无水乙醇超声清洗,纯N₂干燥,最后置于紫外灯下灭菌30 min,备用。

实验中所用试剂均为国药集团化学试剂有限公司生产,分析纯试剂。所用高纯N₂ (>99.999%),来自中国青岛海利气体有限公司。

1.2 实验溶液

实验中所用的脱硫弧菌和溶藻弧菌均通过对907钢三亚海域全浸区浸泡90 d实海挂样的腐蚀产物分离得到。实验中海水来自中国青岛汇泉湾的净化海水,在立式压力蒸汽灭菌锅 (LDZM-40KCS) 中121 ℃下灭菌20 min。

培养脱硫弧菌所用的培养基是修饰的Postgate's C培养基,成分为：每1 L过滤海水中,0.5 g K₂HPO₄,1 g NH₄Cl,0.1 g CaCl₂,2 g MgSO₄,0.5 g Na₂SO₄,4 mL乳酸钠和1 g酵母粉。采用1 mol/L NaOH调节培养基pH值到 (7.0±0.2)。接种前,通入高纯N₂除氧1 h。培养基使用前在立式压力蒸汽灭菌锅中121 ℃下灭菌20 min。将培养了4 d的脱硫弧菌在室温下接种,密封并在30 ℃下培养。

培养溶藻弧菌所用的培养基为2216E,其成分为：每1 L过滤海水中,蛋白胨5 g,酵母粉1 g,高磷酸铁0.01 g。培养基使用前在立式压力蒸汽灭菌锅中121 ℃下灭菌20 min。将培养了1 d的溶藻弧菌在室温下接种,报纸包封瓶口并在30 ℃摇床培养。

分别取出在对数生长期的脱硫弧菌和溶藻弧菌母液,离心、清洗、浓缩。测量这些菌液的吸光度 (OD₆₀₀),并根据标准曲线算出细菌浓度并调整至2.0×10⁷ cfu/mL。在装有396 mL无菌海水的500 mL广口瓶中分别加入4 mL无菌海水,2 mL脱硫弧菌菌液+2 mL无菌海水,2 mL溶藻弧菌菌液+2 mL无菌海水,2 mL脱硫弧菌菌液+2 mL溶藻弧菌菌液,得到无菌对照、脱硫弧菌、溶藻弧菌和混合菌4组实验体系。

1.3 平均腐蚀速率测定

907钢腐蚀速率测试试样在各实验体系中浸泡8 d后,使用Clark's溶液 (ASTM G1-03) 清洗除去腐蚀产物,然后用蒸馏水、无水乙醇冲洗,N₂干燥,称重。腐蚀速率按暴露在溶液中试样单位面积的失重进行计算。

1.4 腐蚀形貌观察

采用扫描电子显微镜 (SEM, Hitachi S-3400N) 进行形貌观察。观察前,首先用体积分数为2.5%的戊二醛溶液浸泡样品2 h以固定表面产物和附着膜;然后依次用体积分数为30%、50%、70%、90%、100%的无水乙醇浸泡15 min,脱水;最后采用超临界干燥,喷金。为进一步观察907钢腐蚀后的基体形貌,观察前,采用Clark's溶液去除表面生物膜与腐蚀产物。

1.5 电化学实验

将灭菌的电极、橡胶塞和盛有4种实验溶液的广口瓶 (作为电解池) 在超净台中进行组装。将体系进行密封,在30 ℃培养以供电化学测试。

在8 d内,采用GAMRY3000电化学工作站测量907钢在4种实验介质中的开路电位 (OCP) 和电化学阻抗谱 (EIS)。在三电极体系中,907钢电极为工作电极,石墨为对电极,Ag/AgCl电极 (3 mol/L KCl) 为参比电极。在OCP下进行EIS测试,施加的扰动电位是±5 mV,测量频率范围10⁵~10^-2 Hz。所有的电化学测试均在 (25±2) ℃下进行。测试3组平行体系以保证EIS结果的重现性。

2 结果与讨论

2.1 腐蚀过程体系状态

图1为907钢在各实验体系中浸泡8 d后的数码相片。在无菌对照及脱硫弧菌体系中,体系状态较为类似。整个实验周期内,溶液较为澄清,体系各构件包括电极导线等没有明显颜色变化,红棕色腐蚀产物在基体表面不断生成积累 (图1a和b)。

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图1   907钢试样在4种不同介质体系中浸泡8 d后的数码照片

Fig.1   Digital photos of 907 steel samples after immersion in abiotic blank (a), Desulfovibrio sp. (b), Vibrio alginolyticus (c) and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus (d) media for 8 d

在溶藻弧菌体系中,实验开始4 h后至第3 d溶液逐渐变成乳白色且浊度不断增加,从第4 d开始溶液浊度下降,白色物质逐渐沉降到瓶底,原本光亮的基体表面因为腐蚀产物的附着逐渐变得黯淡,过程中伴随黄白色代谢产物形成 (图1c)。这说明在无菌海水中,溶藻弧菌快速适应环境,很快进入对数生长期,但生长周期较短,加之体系中缺乏营养物质供能,细菌难以长久存活。

在混合菌体系中,实验前3 d溶液呈乳白色,从第4 d开始导线呈现黑色,并且颜色不断加深,黑色腐蚀产物在基体表面附着,厚实致密的黄白色生物膜积聚形成 (图1d)。导线颜色变黑,且不断加深,说明实验后期脱硫弧菌在混合菌体系中存活并不断繁殖,生成标志性代谢产物H₂S。这可能是由于实验初期溶藻弧菌在生长代谢过程中,消耗了海水中的O₂,为厌氧微生物脱硫弧菌的存活繁殖提供了合适的环境条件。

2.2 平均腐蚀速率

图2为907钢试样在不同介质体系中浸泡8 d的失重数据。在无菌对照和脱硫弧菌体系中,腐蚀速率接近且均超过0.2 mgcm^-2d^-1,较溶藻弧菌和混合菌体系中要高。907钢试样在混合菌体系中浸泡8 d,失重低于0.1 mgcm^-2d^-1,腐蚀速率最低。

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图2   907钢试样在4种不同体系中浸泡8 d后的失重数据

Fig.2   Weight losses of 907 steel after immersion in different media for 8 d

图3为907钢试样在溶藻弧菌和混合菌体系中浸泡4 h,1 d,3 d,5 d,8 d后的平均失重数据。在两种体系中浸泡4 h时,腐蚀速率均最大,皆超过3.0 mgcm^-2d^-1。浸泡1 d时,腐蚀速率有显著的大幅度下降,均低于0.4 mgcm^-2。其后,随浸泡时间增加,两种体系中的腐蚀速率均不断微弱减小。在混合菌体系中,浸泡4 h~3 d,腐蚀速率从3.68 mgcm^-2d^-1降低至0.23 mgcm^-2d^-1,均较同时间溶藻弧菌体系中腐蚀速率大 (3.2和0.18 mgcm^-2d^-1);浸泡4~8 d时,腐蚀速率从0.1 mgcm^-2d^-1微弱降低至0.09 mgcm^-2d^-1,较同时间溶藻弧菌体系中腐蚀速率小 (0.14 和0.13 mgcm^-2d^-1)。

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图3   907钢试样在溶藻弧菌和混合菌体系中浸泡不同时间的平均失重数据

Fig.3   Weight losses of 907 steel after immersion in Vibrio alginolyticus and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus media for different time

2.3 腐蚀形貌

图4为907钢试样浸泡在不同体系中8 d后表面腐蚀产物的微观形貌。由SEM像可以看出,在无菌对照和脱硫弧菌体系中 (图4a和b),腐蚀产物形貌类似,白色片状物质交联重叠,形成菜花样结构,在整个试样表面呈簇状分布。脱硫弧菌体系中,在试样表面未观察到细菌的附着以及代谢产物形成的生物膜,说明脱硫弧菌在无菌海水中没有存活繁殖,这可能是由于海水中存在一定浓度的O₂,抑制了厌氧菌脱硫弧菌的生长,使得脱硫弧菌体系发生与无菌对照体系类似的吸氧腐蚀过程,并呈现相似的腐蚀产物形貌。实验过程中,脱硫弧菌体系中电极导线颜色未发生明显变化,即没有能使导线变黑的脱硫弧菌标志性代谢产物H₂S的产生,证明脱硫弧菌在无菌海水中未能存活繁殖,因而对907钢的海水腐蚀没有产生影响。

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图4   907钢试样在不同体系中浸泡8 d后腐蚀产物的SEM像

Fig.4   Surface morphologies of 907 steel after immersion in abiotic blank (a), Desulfovibrio sp. (b), Vibrio alginolyticus (c) and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus (d) media for 8 d

在溶藻弧菌体系中 (图4c),基体表面附着一层疏松、多孔、不均匀的生物膜。通常,生物膜中细菌和代谢产物会相互粘连共同存在形成生物膜,但在溶藻弧菌体系中未观察到细菌的存在,这可能是由于溶藻弧菌生长周期短,且体系中缺乏营养物质持续供能,实验进行到第8 d时,细菌早已衰亡殆尽。在混合菌体系中 (图4d),试样表面附着较溶藻弧菌体系中更加厚实紧密的生物膜,这可能是由于实验中后期,脱硫弧菌存活,高效独特的代谢增殖活动使形成的生物膜具有更好的稳定性。在混合菌体系中,也未观察到细菌的存在,这可能是因为细菌嵌入了厚实致密的代谢产物膜中。

图5为907钢试样在4种实验介质中浸泡8 d除去表面腐蚀产物后基体的微观形貌。在无菌对照与脱硫弧菌体系中 (图5a和b),基体的腐蚀类型相同,腐蚀程度相近,粗糙度大,腐蚀程度较为严重。在溶藻弧菌和混合菌体系中 (图5c和d),基体的腐蚀类型相似,粗糙度小,可以观察到来自于电极处理的划痕,腐蚀程度均弱于无菌对照和脱硫弧菌体系中的。

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图5   907钢试样在不同体系中浸泡8 d后除去腐蚀产物后的表面SEM像

Fig.5   Surface morphologies of 907 steel after removal of the rust layers formed after immersion in abiotic blank (a), Desulfovibrio sp. (b), Vibrio alginolyticus (c) and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus (d) media for 8 d

2.4 开路电位

图6是907钢在4种实验体系中的OCP随时间变化的曲线。可以看出,在无菌对照和脱硫弧菌体系中,907钢的电位数值接近,变化趋势相同。从实验开始到第1 d快速显著负移;在第2~8 d,电位逐渐微弱正移;在实验中后期基本保持稳定,且实验结束时电位值要负于初始值。在上述两种体系中电位数值接近,变化类似,说明脱硫弧菌在无菌海水中对腐蚀没有影响。在溶藻弧菌和混合菌体系中,907钢的电位变化趋势类似。从实验开始到第1 d,电位快速显著负移;在第2~8 d,电位不断正移;至实验结束时电位值正于初始值。

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图6   907钢在4种不同体系中自腐蚀电位随时间的变化曲线

Fig.6   Variatios of OCP of 907 steel with time in different media

2.5 电化学阻抗谱

图7所示为907钢浸泡在不同实验介质中不同时间 (1~8 d) 后的Nyquist图。在无菌对照和脱硫弧菌体系中 (图7a和b),容抗弧形状相近且阻抗模值变化趋势类似。浸泡4 h~1 d,阻抗模值明显减小,这是溶液腐蚀的结果。浸泡1 d之后,阻抗模值逐渐增大,这可能是腐蚀产物覆盖试样表面对基体有一定的腐蚀减缓作用。到第8 d时,阻抗模值仍小于浸泡4 h的初始值,且在整个实验过程中,阻抗模值数值较小且变化幅度不大。阻抗模值一般与金属耐蚀性呈正比,表明在无菌对照和脱硫弧菌体系中,907钢的腐蚀随时间增加逐渐加重。在两种体系中Nyquist图基本相似,表明Desulfovibrio sp.单独存在于灭菌天然海水中对907钢的腐蚀没有影响。这一结论与两种体系中腐蚀产物及基体SEM像分析结果一致。虽然曾有文献报道^[18,19],脱硫弧菌可利用各种防御机制,耐受氧气而存活,但在本研究体系中并未发生。

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图7   907钢浸泡在不同体系中的Nyquist和Bode图随时间的变化

Fig.7   Nyquist (a~d) and Bode (a1~d1) plots of 907 steel after immersion in abiotic blank (a, a1), Desulfovibrio sp. (b, b1), Vibrio alginolyticus (c, c1) and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus (d, d1) media for different time

在溶藻弧菌和混合菌体系中,容抗弧呈现相近的形状 (图7c和d),阻抗模值变化趋势类似且与无菌对照和脱硫弧菌体系中的相反 (图7c1和d1)。在整个实验过程中,阻抗模值数值及变化幅度都较大。浸泡4 h~1 d,阻抗模值显著增大。浸泡1 d之后,阻抗模值逐渐减小;到第8 d时,阻抗模值仍大于浸泡4 h的初始值。以上变化表明,907钢在溶藻弧菌和混合菌体系中,随时间增加腐蚀逐渐被抑制。而在混合菌体系中,浸泡8 d的阻抗模值较4 h的增加更多,说明该体系中腐蚀抑制作用更明显。文献^[20]曾报道,溶藻弧菌可通过去除金属钝化膜,促使腐蚀性S^2-攻击基体表面,以此加速SRB导致的金属腐蚀。

溶藻弧菌对907钢的腐蚀抑制作用与其结论不一致,这可能是由于菌株种类、金属材料、电解液、实验培养方式、观察时间等差异造成的。

为了便于比较,将4个体系浸泡相同时间的阻抗模值放在同一张图中进行比较 (图8)。据文献^[21]报道,在被接种到新环境体系中后,细菌在最初的一段时间里,主要进行环境适应、代谢积累等活动,对腐蚀影响不大。由图8a可知,907钢在各体系浸泡4 h时,4条Nyquist曲线阻抗模值都较小,根据容抗弧形状和阻抗模值,可分为各自相近的两组。溶藻弧菌和混合菌体系中阻抗模值较无菌对照和脱硫弧菌体系中的稍大,说明溶藻弧菌已快速适应环境,并开始生长增殖活动。浸泡1 d后,各体系阻抗模值发生了最大幅度的变化,无菌对照和脱硫弧菌体系中的阻抗模值显著减小;溶藻弧菌和混合菌体系中的阻抗模值显著增加 (图8b)。此后,各体系阻抗模值逐渐开始反向变化。4 h~3 d时,阻抗模值大小顺序为：无菌对照≈脱硫弧菌<混合菌<溶藻弧菌。无菌对照和脱硫弧菌体系发生有氧腐蚀,随时间增加,腐蚀程度不断增加。在溶藻弧菌体系中,由于细菌的生长消耗O₂,抑制了体系中有氧腐蚀的进行,且在实验前3 d,细菌的耗氧代谢及生长增殖最为旺盛,故腐蚀速率最小。混合菌体系中,脱硫弧菌对907钢腐蚀的影响是基于溶藻弧菌的协同作用。实验前3 d,溶藻弧菌耗氧代谢为厌氧微生物脱硫弧菌的存活生长提供了适宜的条件,但是脱硫弧菌的腐蚀促进作用在该体系中并没有占据主导地位,只能部分抵消溶藻弧菌的腐蚀抑制影响。4~8 d时,阻抗模值大小顺序为：无菌对照≈脱硫弧菌<溶藻弧菌<混合菌。在浸泡中后期,溶藻弧菌体系中的阻抗模值显著减小,这可能是因为溶藻弧菌生长周期短,加之营养供能物质的匮乏,细菌早已衰亡殆尽,腐蚀抑制作用减弱。混合菌体系中的腐蚀速率最小,则可能是由于脱硫弧菌形成的生物膜致密稳定,阻碍了腐蚀性物质的传递,减弱了907钢在该体系中的腐蚀程度。这与失重数据和SEM观察结果相一致。

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图8   907钢在4种不同体系中浸泡不同时间的EIS比较

Fig.8   Comparisons of Nyquist plots of 907 steel after immersion in different solutions for 4 h (a), 1 d (b), 2 d (c), 3 d (d), 4 d (e), 5 d (f), 6 d (g), 7 d (h) and 8 d (i)

采用图9中等效电路图,用ZSimpWin软件对各体系的EIS结果进行拟合。其中,R_s为溶液电阻,Q_dl为双电层电容,n_dl表示双电层电容指数,R_ct为电荷转移电阻,Q_f为膜电容,n_f表示膜的电容指数,R_f为膜电阻。拟合结果见表1。

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图9   907钢浸泡在不同体系中所对应的等效电路

Fig.9   Equivalent circuits for EIS of 907 steel immersed in abiotic blank, and Desulfovibrio sp. (a) and Vibrio alginolyticus and Desulfovibrio sp.+Vibrio alginolyticus (b)

从表1的数据结果结合图10可知,在无菌对照和脱硫弧菌体系中,R_ct变化趋势类似且数值接近,随浸泡时间的延长呈现先下降后增加的趋势,但始终小于初始值。表明在两种体系中,腐蚀均被促进且速率相近。R_ct在实验初期的显著减小表明907钢在溶液体系中发生腐蚀,R_ct在实验后期缓慢增大是由于腐蚀产物覆盖试样表面从而对基体产生保护作用。在溶藻弧菌和混合菌体系中,R_ct的变化情况也基本相同,并与无菌对照和脱硫弧菌体系中趋势相反,随浸泡时间的延长先增加后减小,终了值大于初始值。说明在这两种体系中腐蚀被抑制,腐蚀速率先减小后增加。R_ct在试样浸泡1 d之前显著增加,表明细菌在进入新环境体系后,在基体表面附着并进行代谢积累。R_ct在1~3 d期间急剧减小,表明细菌在对数生长期大量消耗体系中的O₂,显著降低腐蚀速率。在实验前3 d,溶藻弧菌体系中R_ct始终大于混合菌体系中的,说明脱硫弧菌在溶藻弧菌提供的无氧环境中存活且在一定程度上加速腐蚀。在3 d之后,溶藻弧菌和混合菌体系中R_ct均缓慢减小,终了值大于初始值,且混合菌体系中数值较溶藻弧菌中的大,说明混合菌的腐蚀抑制作用较溶藻弧菌的更明显。

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图10   907钢在不同体系中R_ct随浸泡时间的变化

Fig.10   Changes of R_ct of 907 steel immersed in different media with time

由以上结果可知,在确定的环境体系中,细菌对907钢的腐蚀影响规律与细菌种类、代谢特点及生长规律以及多种细菌间协同作用有关。

3 结论

(1) 在单一菌种体系中,脱硫弧菌对907钢的腐蚀无影响,这是因为无菌海水中一定浓度O₂的存在及营养物质的匮乏,抑制脱硫弧菌的存活和繁殖;而溶藻弧菌通过消耗氧气进行的代谢增殖活动抑制了907钢的有氧腐蚀过程。

(2) 在混合菌体系中,溶藻弧菌的耗氧代谢活动,一方面减缓抑制体系中的有氧腐蚀过程,另一方面为脱硫弧菌的生长增殖提供了条件。脱硫弧菌对腐蚀的促进是基于溶藻弧菌的协同作用,但在腐蚀过程中未占主导地位;脱硫弧菌代谢生成的致密生物膜对腐蚀的深入发展造成阻碍,腐蚀抑制作用更加明显。

The authors have declared that no competing interests exist.